circRNA通过诱导c-Myc入核促进肿瘤发生

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声 明

        6月16日，Nature子刊 Cell Death & Differentiation在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的文章，介绍发现了circRNA circ-Amotl1通过诱导c-Myc入核而促进肿瘤发生[1]。就在前不久，杨教授刚刚发表了文章介绍该circRNA在创口愈合过程中发挥重要作用[2]。

        文中作者围绕circRNA circ-Amotl1在肿瘤中的作用机制展开了相关探索研究，发现circ-Amotl1能够通过诱导c-Myc入核促进肿瘤生成[1]。

circ-Amotl1在肿瘤细胞中的作用

        circ-Amotl1由位于11号染色体的Amotl1基因的第三外显子形成。在乳腺癌标本中， circ-Amotl1的表达量明显高于癌旁组织。一些常见的肿瘤细胞系也表现出了circ-Amotl1高表达的特性。有趣的是，作者发现在细胞处于长满培养皿的状态后，circ-Amotl1的表达会降低，这也暗示着circ-Amotl1与细胞增殖有关。

图1 circ-Amotl1在肿瘤中高表达，与肿瘤细胞增殖有关（来自[1]，排列方式有改动）

        分别设计针对circ-Amotl1和线性Amotl1的mRNA的siRNA，表明干扰circ-Amotl1明显抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。

图 2 干扰circ-Amotl1后抑制细胞增殖并促进细胞凋亡（来自[1]，排列方式有改动）

过表达circ-Amotl1促进细胞增殖

        作者构建了过表达circ-Amotl1的载体，实验验证后表明过表达circ-Amotl1并不显著影响内源性Amotl1基因mRNA的RNA水平和翻译水平，也不影响Amotl1蛋白的相互作用分子状态。但过表达circ-Amotl1能显著提高细胞增殖能力，抵抗血清饥饿和细胞凋亡。

图3 过表达circ-Amotl1促进细胞增殖（来自[1]）

circ-Amotl1对肿瘤裸鼠模型的影响

        分别在MDA-MB-231 或HepG2细胞构建的裸鼠皮下肿瘤模型中，过表达circ-Amotl1明显促进肿瘤增殖，肿瘤组织的体积明显增加。单细胞克隆生成实验也表明过表达circ-Amotl1明显促进肿瘤克隆生成速度，比对照组快了近30倍。过表达circ-Amotl1后细胞倍增时间缩短至15-18h，明显高于对照细胞。

图4 过表达circ-Amotl1促进肿瘤生成（来自[1]）

circ-Amotl1与c-Myc相互作用

        为弄清楚过表达circ-Amotl1促进细胞增殖和肿瘤形成的机制，作者利用常见的促进细胞增殖的基因的抗体进行RIP实验，看哪种蛋白结合circ-Amotl1的能力最强。结果表明c-Myc、EGF、c-Myb、NF1和AKT的抗体能够明显的钓取到circ-Amotl1分子，其中c-Myc是作用最强的。作者也反复验证了c-Myc与circ-Amotl1的相互作用情况，特异性靶向circ-Amotl1的环化位点的探针也可以直接钓取到c-Myc蛋白，说明circ-Amotl1与c-Myc 的相互作用是客观稳定的。

图5 circ-Amotl1与c-Myc 相互作用（来自[1]）

circ-Amotl1促进c-Myc的功能 

        c-Myc是重要的转录因子，作者接下来分析了常见的受c-Myc 调控的基因在过表达circ-Amotl1后的表达状态，结果表明过表达circ-Amotl1能明显促进下游基因的表达。circ-Amotl1促进c-Myc 结合下游基因启动子的能力。在c-Myc阴性的HO15.19细胞中过表达circ-Amotl1不会促进细胞增殖，干扰circ-Amotl1后c-Myc下游基因的表达同步下降。

图6 circ-Amotl1促进-Myc调控的下游基因的表达（来自[1]）

        分离亚细胞组分后鉴定结果表明circ-Amotl1和c-Myc均主要定位于细胞核内，而干扰circ-Amotl1后c-Myc定位于核内的比例明显减少。交联实验也证实了circ-Amotl1与c-Myc相互作用共定位的关系。原位杂交+免疫荧光实验也证明circ-Amotl1与c-Myc共定位在细胞核中。

图7 circ-Amotl1与c-Myc在细胞核中共定位（来自[1]）

circ-Amotl1与c-Myc相互作用

        通过计算机模拟，作者模拟了circ-Amotl1与c-Myc相互作用的3D模型图。并通过不同的软件预测了两者相互作用的氨基酸和碱基对应关系。然后利用RNA pull-down和RIP等实验证实了预测的相互作用位点。最后在小鼠模型中验证了所设计的突变分子失去了促进肿瘤生成的作用。

图8 circ-Amotl1与c-Myc相互作用位点分析（来自[1]）

        本文首次发现circRNA通过促进c-Myc入核，促进其发挥功能，为circRNA功能研究提供了新思路。

参考文献：

1. Yang, Q., et al., A circular RNA promotes tumorigenesis by inducing c-myc nuclear translocation. Cell Death Differ, 2017.

2. Zhen-Guo Yang, F.M.A., William W Du, Yan Zeng, Juanjuan Lyu, De Wu, Shaan Gupta, Weining Yang and Burton B Yang, The circular RNA circ-Amotl1 interacts with STAT3 increasing its nuclear translocation and wound repair by modulating Dnmt3a and miR-17 function. Molecular Therapy, 2017.

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