杨柏华教授全新力作-circRNA可促进创口愈合

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声 明

        6月5日，Cell出版集团旗下杂志Molecular Therapy在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的文章，介绍发现一种circRNA circ-Amotl1在创口愈合模型中可加速愈合过程[1]。

        文中作者分析了circRNA circ-Amotl1促进创口愈合进程的机制，发现过表达circ-Amotl1后促进Stat3的表达和入核，进而促进Dnmt3a的表达，Dnmt3a促进miR-17基因的启动子区，抑制后者的表达。由于Stat3、Dnmt3a和fibronectin是miR-17-5p的调控靶标分子，降低的miR-17-5p在促进了Stat3、Dnmt3a和fibronectin的富集，进而促进了细胞增殖，迁移以及创口愈合[1]。

circ-Amotl1过表达载体可加速创口愈合过程

        作者首先利用宫腔穿刺针构建了表皮创口模型，在同一小鼠的背部两侧构建了直径5mm的创口模型，然后每隔一天分别对创口处注射circ-Amotl1的过表达载体和空载体。等到第六天的时候注射circ-Amotl1的创口愈合明显好于对照载体。组织HE染色和免疫组化检测也表明过表达circ-Amotl1后创口处组织的愈合再生活动增强。

图1 circ-Amotl1过表达载体可加速创口愈合过程（来自[1]）

        由于激素分泌状态会影响创口愈合的效果，作者分别在雌雄小鼠上进行了实验分析，结果显示不论雌雄个体，过表达circ-Amotl1均可加速创口的愈合。细胞增殖标志Ki67和血管标志CD34在注射circ-Amotl1的创口处均明显增多。circ-Amotl1特异性的核酸探针也表明的确是存着circRNA circ-Amotl1过表达。

图2 过表达circ-Amotl1创口不同标志物鉴定（来自[1]）

过表达circ-Amotl1促进细胞迁移，粘附和增殖

        成纤维细胞在创口愈合中发挥重要作用，为此作者选择小鼠成纤维细胞系NIH 3T3细胞进行细胞学分析。为分析circ-Amotl1对细胞的影响，作者构建了过表达circ-Amotl1的NIH 3T3细胞，并进行了Transwell实验，Petri dish粘附实验和细胞增殖分析，结果表明过表达circ-Amotl1能明显促进NIH 3T3细胞的迁移，粘附能力和增殖活力和生存能力。单细胞培养实验也表明过表达circ-Amotl1能明显促进细胞的增殖能力。作者还选择了人的牙龈成纤维细胞HGF进行了验证，结果与NIH 3T3细胞的结论符合。在HGF细胞中通过RNAi干扰内源性circ-Amotl1则抑制HGF细胞的增殖和迁移等指标。

图3 过表达circ-Amotl1促进细胞迁移，粘附和增殖（来自[1]，排列方式有改动）

circ-Amotl1与Stat3 相互作用

        由于circ-Amotl1能明显促进细胞增殖，作者假设circ-Amotl1可与细胞有丝分裂相关的基因存着联系。于是，作者通过RIP实验进行筛选验证，即基于商业化的抗体进行免疫沉淀实验，然后看沉淀产物中是否能测到circ-Amotl1，同时以线性Amotl1作为对照。总共分析了15种蛋白的抗体，包括：E2F1、E2F5、E2F4、EGF、ETS-1、HIF-1α、AP1、NF1、Stat1、Sox2、Par4、Stat3、ID1、Erk和 Ago2。结果表明在E2F1、E2F4、EGF、ETS-1、AP1、NF1和Stat3 存着阳性信号，其中circ-Amotl1与Stat3的作用最强。于是作者又进一步通过正向和反向的实验设计充分验证了circ-Amotl1与Stat3 相互作用

图4 circ-Amotl1与Stat3 相互作用（来自[1]）

circ-Amotl1与Stat3的相互关系探索

        为探明Stat3在circ-Amotl1促进细胞迁移和增殖中所起的作用，作者首先基于信息学预测分析找到miR-17-5p是最有可能的候选作用分子，于是在过表达circ-Amotl1的细胞中分析了miR-17-5p、Stat3以及Dnmt3a和fibronectin（两个miR-17-5p直接调控的基因）的表达状态，结果表明当miR-17-5p下降时Stat3、Dnmt3a和fibronectin的mRNA水平和蛋白水平表达会增高。而在注射过表达circ-Amotl1的创口处Stat3、Dnmt3a和fibronectin的表达也会增高。并且，干扰circ-Amotl1后miR-17-5p增高，伴随着Stat3、Dnmt3a和fibronectin的蛋白水平下降。

        那么这几个基因的相互关系又是怎样的呢？作者通过敲低和过表达Stat3获得了线索，过表达Stat3可促进Dnmt3a和fibronectin的表达，同时降低miR-17-5p的表达，而干扰Stat3后则出现相反的结果。这表明在这一通路机制中，Stat3是Dnmt3a、fibronectin及miR-17-5p的上游。干扰Dnmt3a后明显降低fibronectin的表达。

图5 circ-Amotl1与Stat3的相互关系（来自[1]）

miR-17-5p在circ-Amotl1介导的创口愈合过程中的作用

        作者在早期构建了miR-17转基因小鼠C57BL/6xCBA，于是作者在该小鼠模型中分析了过表达circ-Amotl1对创口愈合的影响情况，以同品系的小鼠为对照。结果表明在miR-17转基因小鼠中过表达circ-Amotl1对创口愈合的影响减弱，变现为相对于对照组，miR-17转基因小鼠中过表达circ-Amotl1后创口愈合速度变慢。在miR-17转基因小鼠的创口组织中Dnmt3a和fibronectin的表达也受到了抑制。增殖标志Ki67以及血管标志CD34也明显降低。

        作者早期的研究就表明miR-17-5p调控Dnmt3a和fibronectin的表达，本文的工作预示着Stat3也可能是miR-17-5p的靶标。于是作者通过构建Stat3基因的3’UTR荧光素酶报告系统，分析miR-17-5p对Stat3的调控作用，基于点突变设计，表明miR-17-5p可直接影响Stat3基因的表达。过表达miR-17也可降低Stat3的表达。过表达miR-17也可降低细胞增殖和迁移等指标，说明miR-17-5p可直接调控Stat3基因。

图6 miR-17-5p直接调控Stat3（来自[1]）

circ-Amotl1、Stat3、Dnmt3a、fibronectin和miR-17-5p的相互调控关系

        为什么过表达circ-Amotl1能促进Dnmt3a 表达呢？由于Stat3是一种转录因子，会不会是circ-Amotl1促进了Stat3结合到启动子区诶促进了基因转录表达？从亚细胞分布来看，circ-Amotl1主要位于核内，交联实验也表明circ-Amotl1和Stat3在核内存着相互作用。过表达circ-Amotl1后创口组织中circ-Amotl1和Stat3均在细胞核内增多。过表达circ-Amotl1的细胞模型中也能检测到核定位的circ-Amotl1和Stat3。

图7 circ-Amotl1与Stat3均定位于细胞核中（来自[1]）

        为证明circ-Amotl1促进Stat3定位于Dnmt3a启动子区，作者进行ChIP实验进行分析，结果表明circ-Amotl1和Stat3在Dnmt3a启动子区有共定位。抗Stat3的抗体钓取的染色体片段可明显扩增出Dnmt3a启动子区特异性的片段，说明Stat3可定位于Dnmt3a启动子区。过表达circ-Amotl1后信号有所增强，说明circ-Amotl1促进了Stat3定位于Dnmt3a启动子区。而通过RNA干扰实验干扰Stat3后则降低检测信号。基于这一系列的实验数据，作者提出一个假设模型：过表达circ-Amotl1后促进Stat3的表达，进而促进Dnmt3a的表达，Dnmt3a促进miR-17基因的启动子区，抑制后者的表达。由于Stat3、Dnmt3a和fibronectin是miR-17-5p的调控靶标分子，降低的miR-17-5p在促进了Stat3、Dnmt3a和fibronectin的富集，进而促进了细胞增殖，迁移以及创口愈合。

        进一步的实验也验证了这一模型，过表达circ-Amotl1后确实和减少miR-17的表达，进而减少了miR-17-3p和miR-17-5p的表达。在过表达circ-Amotl1的细胞中干扰Stat3或Dnmt3a则会提高miR-17的表达。

图8 过表达circ-Amotl1促进创口愈合的机制（来自[1]）

计算机模拟表明circ-Amotl1与Stat3相互作用

        作者利用分子模拟实验（Docking）分析了circ-Amotl1与Stat3相互作用的分子机制，结果表明Stat3存着RNA相互作用的同源性结构特征，分子模拟实验也找出了circ-Amotl1与Stat3相互作用的motif。基于分子模拟的结果，作者设计了与互作序列互补的核酸片段进行了封闭效果分析，结果表明这种封闭分子能阻止circ-Amotl1在细胞水平的各种效应，包括抑制了过表达circ-Amotl1后导致的Stat3、Dnmt3a和fibronectin的表达升高，也提高了miR-17的表达，同时也抑制了过表达circ-Amotl1后促进细胞增殖和迁移能力的效应。

图9 circ-Amotl1与Stat3相互作用的分子机制（来自[1]）

        皮肤组织创口愈合是非常重要的机体功能，糖尿病或动脉粥样硬化患者往往表现出窗口愈合速度变慢的情形，严重威胁患者的健康。本文证明了circRNA circ-Amotl1可促进创口愈合的速度，或许为这类临床问题带来有益的借鉴，也为日后开发基于circRNA的疾病治疗策略提供了有益的借鉴。

参考文献：

Zhen-Guo Yang, F.M.A., William W Du, Yan Zeng, Juanjuan Lyu, De Wu, Shaan Gupta, Weining Yang and Burton B Yang, The circular RNA circ-Amotl1 interacts with STAT3 increasing its nuclear translocation and wound repair by modulating Dnmt3a and miR-17 function. Molecular Therapy, 2017.

杨柏华教授将亲自莅临“第三届环状RNA研究论坛”，赶快报名吧！

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