Cell杂志在线发表陈玲玲教授最新lncRNA研究文章
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声 明
5月4日，Cell 杂志在线发表了中科院上海生化细胞所陈玲玲教授团队最新的研究论文，介绍一类非编码RNA SLERT 通过影响DDX21环状结构调控RNA聚合酶I的转录活动[1]。下面就让山人和大家一起剖析学习一下这篇文章。
本文讲述了一个什么故事？
本文作者发现了一种sno-lncRNA：SLERT，它通过结合DDX21影响后者的分子内构象，降低与RNA聚合酶I的结合能力，释放RNA聚合酶I，促进rRNA的转录[1]。
图1 SLERT 通过影响DDX21环状结构调控RNA聚合酶I的转录活动（来自[1]）
那么，SLERT 是怎样发现的？如何发现SLERT 与DDX21相互作用的？DDX21的环形结构和在rRNA转录过程中的作用模式如何发现的？怎样证明SLERT与DDX21相互作用影响RNA聚合酶I介导的rRNA转录过程的？本文的科学意义是什么？为什么可以发表在Cell杂志上？对我们的研究有什么启发？……
相信广大同行一定和山人一样，在看到这篇文章的时候会产生这一系列的问题。下面就让我们一起解读和学习一下这篇文章吧：
1. SLERT是怎样发现的？
作者在前期的一项研究中开展了不含Poly(A)的RNA转录组 [2]，其中发现了一类sno-lncRNA，SLERT正是在这项研究中发现的。SLERT长694nt，两端分别为box H/ACA 家族的snoRNA：SNORA5A 和SNORA5C。基因组定位分析表明，SLERT来自TBRG4基因。TBRG4基因转录产物可以正常加工获得成熟的TBRG4基因及SNORA5A 和SNORA5C，也可以通过跨过外显子4和5，产生一种截短型的TBRG4基因并生成SLERT。
图2 SLERT的结构和转录生成（来自[1]，有改动）
表达状态分析初步表明SLERT在人的胚胎干细胞H9和卵巢癌细胞系PA1中均高表达，在其他一些细胞系中也有不同程度的表达。TBRG4基因、截短型TBRG4及SLERT在细胞内降解的速度比较快，说明细胞存在一系列复杂的调控这些基因表达的机制。
图3 SLERT在不同细胞中的表达情况（来自[1]，有改动）
作者也通过DCP1的RIP实验进一步验证了SLERT两端存在box H/ACA 家族的snoRNA。那么，这两端的box H/ACA 家族的snoRNA对于SLERT有什么意义？作者选择SLERT表达丰度较低的Hela细胞进行突变体实验，分别构建了两侧snoRNA的loop结构及H motif的删除突变，然后通过Northern杂交看SLERT的表达。结果表明两侧靠外侧的loop结构，H motif及3’端的ACA box结构对于SLERT的生成至关重要。作者推测可能是两侧的snoRNA与相互作用蛋白形成的复合物可以保护SLERT免受外切核酸酶的消化，从而对的SLERT生成有帮助。
图4 两端的snoRNA调控SLERT的生成（来自[1]）
SLERT的定位是研究其功能的重要切入点。作者首先通过生化分离亚细胞组分的方法证明SLERT定位于细胞核的核仁区域。有趣的是，转录产生SLERT的基因TBRG4并不在核仁区附近。因此SLERT必定是转录加工成熟后以某种方式转移定位至核仁区的。是什么因素决定其定位的呢？于是作者分别构建了删除内侧loop结构（不影响RNA加工成熟）的突变以及将中间的序列完整的替换为egfp基因序列的突变体，看其对成熟RNA定位的影响，结果表明替换中间的序列不影响其定位，而两侧的snoRNA的内侧loop删除突变则无法准确定位至核仁。因此SLERT两侧的snoRNA还是其准确定位至核仁的关键因素。
图5 SLERT定位于核仁的机制（来自[1]）
2. 如何发现SLERT 与DDX21相互作用的？
弄清楚了SLERT的生成和定位的机制后，SLERT的功能研究就成了问题的焦点了。以CRISPR技术为代表的基因打靶技术可有效敲除基因，是新基因功能研究的利器。作者借助CRISPR技术构建了SLERT的敲除细胞系。这里有个关键的技术问题：如何精确的敲除SLERT而不能影响TBRG4基因及两种snoRNA的表达，否则实验所获得的表型就无法解释究竟是因为哪种分子的表达影响所导致的。
作者设计了靶向两个snoRNA的H box的sgRNA进行精确敲除。经过挑选克隆，最终得到了两株敲除细胞，分别敲除了两侧的snoRNA的H box序列。经鉴定，这两个细胞株中SLERT的完全抑制了，与此同时，TBRG4基因的表达未受到影响。但所对应的snoRNA的生成也受到了相应的抑制。
图6 精确敲除两侧snoRNARNA 的H box的细胞株（来自[1]）
SLERT定位于核仁区，会不会对rRNA的转录或核糖体的组装等活动有关呢？作者首先分析了SLERT基因敲除细胞中rRNA转录状态和中间产物进行了分析，结果表明47S rRNA中间产物的含量明显降低，18S和28S rRNA的生成量也明显降低。与此对应，40S和60S核糖体亚基的生成量也明显降低。究竟是rRNA的转录受到影响还是转录后加工过程受到影响？作者采用脉冲标记的方法回答了这个问题。4-thiouridine (4sU)是尿嘧啶的类似物，可以随着RNA转录过程掺入到新生成的RNA分子中。5-fluorouracil (5-FU)可阻止rRNA的转录加工过程。在5-FU处理条件下脉冲标记4sU，可准确定量新生成RNA的数量。基于该实验，作者发现SLERT基因敲除细胞中rRNA的生成速率明显受到抑制。荧光素酶报告系统实验也显示，rDNA的启动子在SLERT基因敲除后明显受到抑制。反过来，过表达SLERT基因则明显增加rRNA的转录产物量。这些结果表明SLERT基因可调控rRNA的转录过程。
图7 SLERT敲除影响rRNA的转录（来自[1]）
SLERT究竟与什么分子相互作用？作者构建了5’-tSRA标签融合的SLERT，进行RNA Pull-down实验，钓取相互作用的蛋白。将tRSA-SLERT与细胞裂解物进行孵育后钓取相互作用蛋白，5’-tSRA标签作为对照，找出明显差异的蛋白条带，作者最终筛选到DDX21。
图8 SLERT与DDX21相互作用初步鉴定（来自[1]）
进一步，作者分别用RIP，FISH+免疫荧光共定位分析，电泳迁移率改变实验（EMSA）以及体外相互作用序列筛选鉴定等多种技术手段反复验证了SLERT与DDX21的相互作用，并得知SLERT的非snoRNA中间区域中3’侧的一段143nt的序列是SLERT与DDX21相互作用的核心序列。
图9 SLERT与DDX21相互作用验证（来自[1]）
3. 如何发现DDX21的环形结构的？如何研究DDX21的功能？
DDX21是一种DEAD-box家族的RNA解旋酶，目前研究的比较少，Pubmed搜索也只能找到31篇文章相关。2015年曾有一篇Nature文章介绍发现DDX21与rRNA的转录相关[3]。这篇文章中介绍发现DDX21可广泛结合RNA聚合酶I和II调控的基因启动子区，通过结合包括lncRNA在内的多种RNA和蛋白，形成RNA-蛋白复合物，调控核糖体生成相关的RNA和蛋白产物的表达[3]。这篇文章中作者也发现DDX21可定位在rDNA转录区。
图10 DDX21与rRNA的转录有关（来自[3]）
基于这些文献报道，可以肯定DDX21与rRNA的转录有关，与本文的发现可以吻合，似乎到这里可以形成一个相对完整的故事了。科学研究的最大魅力在于旧的问题弄清楚后又会出现新的问题。SLERT与DDX21相互作用如何调控rRNA的转录过程的？这个科学问题并没有完全解释清楚，SLERT与DDX21相互作用调控rRNA转录的时空规律就是下一步需要回答的重要问题方向。
已有的文献报道表明DDX21可以定位在核仁中，但还没有获得更清晰的亚细胞定位DDX21的构造信息。电子显微镜和超高分辨率光学显微镜技术能帮助获得分辨率更高的亚细胞定位结构。作者在本文中选择超高分辨率光学成像分析DDX21的构造信息。基于结构照明超高分辨率显微成像（SIM）技术，作者最终发现DDX21在核仁区域呈现一种直径约400nm的环形结构。
图11 结构照明超高分辨率显微成像（SIM）揭示DDX21呈现环形结构（来自[1]）
为排除细胞固定造成的结构改变，作者构建了N-端或C-端融合荧光蛋白的载体，活细胞观察后证明DDX21在活细胞中也是呈现环形结构的。
图12 活细胞中DDX21也呈现环状结构（来自[1]）
DDX21形成环状结构与rRNA的转录有啥关系呢？作者分别用actinomycin D (AMD，可直接抑制RNA聚合酶I) 和5-FU抑制rRNA的转录和转录后加工，看DDX21结构的变化。结果表明AMD处理后DDX21的环状结构消失了。5-FU则不影响这种结构。
图13 抑制RNA聚合酶I可阻断DDX21形成环状结构（来自[1]）
这一发现表明DDX21形成环状结构与RNA聚合酶I转录活动密切相关。于是作者基于SIM观察，分析了DDX21与RNA聚合酶I的空间定位关系，结果表明RNA聚合酶I的大亚基RPA194的定位非常有趣，RPA194恰好定位于DDX21的环状结构的中间。在多种细胞中也得到了相似的结果。CoIP实验以及DDX21的ChIP实验等也进一步表明DDX21的环形结构定位于rDNA的启动子区，可以与RNA聚合酶I相互作用，促进rDNA的转录。DDX21的RNA干扰实验也佐证了这一现象。
图14 RPA194定位于DDX21的环状结构的中间（来自[1]）
核仁结构大致可分为三个部分：纤维中心（fibrillar center, FC），致密纤维组分（dense fibrillar component, DFC）和颗粒组分（Granular compartment, GC）。rDNA的转录主要在FC和DFC的交界处。共定位分析表明DDX21主要与DFC的marker蛋白fibrillarin（FBL）共定位，但与颗粒组分的marker蛋白B23没有共定位。说明DDX21主要定位在DFC区域。
图15 DDX21定位于DFC区域（来自[1]）
DDX21、RPA194和 rDNA的共定位分析进一步证明，DDX21的环状结构主要定位在FC和DFC交接的区域，该区域正是rDNA进行转录活动的区域。
图15 DDX21定位于DFCFC交界区域（来自[1]）
4. 怎样证明SLERT与DDX21相互作用与rRNA转录的关系？
SLERT与rRNA的转录有关，DDX21的环状结构也与RNA聚合酶I有特殊的空间定位关系，那么SLERT与DDX21的环形结构直接有没有关系？它们与rRNA的转录关系是怎样的？基于共定位分析，作者发现SLERT与DDX21有共定位，但与RNA聚合酶I没有共定位。在SLERT敲除的细胞中未发现DDX21 和RNA聚合酶I表达量的变化，说明SLERT不是在基因表达水平影响后者的。
SIM成像技术可满足对DDX21环状结构的定量分析，于是作者分析了各种SLERT基因敲除和过表达对DDX21环状结构的影响，最终发现SLERT可调控DDX21环状结构的孔径。
图16 SLERT与DDX21共定位调控其环状结构的直径（来自[1]）
SLERT结合DDX21后影响环状结构，那么SLERT究竟是通过改变DDX21分子本身的构象还是改变DDX21分子间相互作用的状态而影响环状结构的呢？作者设计了基于激光共振能量转移的技术分析体系。当两个分子离得非常近的时候，EGFP的发射荧光刚好作为mCherry的吸收波长，直接用EGFP的激发光是不能有效激发mCherry的荧光的，这便是常用的激光共振能量转移技术（FRET）。基于这一技术，可动态分析分子构象的细微变化。作者构建了EGFP和mCherry分别在DDX21分子内和分子间融合表达的质粒，看SLERT敲除对FRET效率的影响，结果表明敲除SLERT可明显改变DDX21分子内构象，但对分子间构象的影响不明显。这说明SLERT结合DDX21后改变了DDX21的构象，从而影响了环状结构的直径。
图17 SLERT结合DDX21改变其分子内构象（来自[1]）
经NoD在线工具预测，DDX21的N-端和C-端具有核仁定位序列，也得到了实验的验证。作者在此基础上构建了各种截短型突变，分析DDX21与和SLERT及聚合酶I相互作用的位点。结果表明DDX21通过不同的位置与两者分别相互作用，但彼此有重叠的区域。DDX21与聚合酶I的相互作用区域主要是一个RecA和C端区域，而与SLERT相互作用的区域为两个RecA区域。
由于RecA结构域为RNA解旋酶结构域，是否该结构参与了rRNA的转录过程？作者通过干扰內源DDX21后过表达突变型DDX21回答该问题。DDX21干扰后，rRNA的转录增加，但回补表达解旋酶活性突变的DDX21后也同时消除了內源DDX21干扰后的影响，说明解旋酶的功能不是DDX21与聚合酶I相互作用后影响后者功能的对应区域。
会不会SLERT结合DDX21后改变了其对聚合酶I的结合能力？这个假设得到了实验的证实。作者设计了体外分析的实验体系，当加入野生型的SLERT时，DDX21与聚合酶I的结合明显降低。体内过表达野生型的SLERT也能增加聚合酶I在rDNA的启动子区的结合。这说明的SLERT结合可减弱DDX21对聚合酶I的结合。
图18 SLERT结合DDX21后降低其对聚合酶I的结合能力（来自[1]）
最后，作者还简单分析了敲除SLERT对克隆生成，体内肿瘤形成速度的影响以及细胞中过表达SLERT对克隆生成和细胞增殖的影响。结果表明SLERT基因敲除后肿瘤克隆形成能力下降，体内肿瘤形成减慢。过表达SLERT基因可促进克隆形成和细胞增殖。
图19 SLERT基因促进肿瘤克隆形成和增殖（来自[1]）
5. 本文的科学意义是什么？对我们有什么启发？
本文为我们呈现了一个非常精彩的lncRNA研究故事，系统的回答了SLERT基因的功能和DDX21在rRNA转录过程中的作用机制问题。基于系统严谨的实验论证，本文首次系统研究SLERT这个作者早期筛选发现的新型sno-lncRNA的功能，首次发现了DDX21形成环状结构调控RNA聚合酶I的功能，大大增进了人们对rRNA转录机制和非编码RNA功能的认识。这也许是本文最终获得国际同行和Cell杂志编委和主编肯定并最终得以发表的最重要的原因。
通过本文的学习，山人受益匪浅，借此机会跟大家一起分享一下：
（1）要拥抱新技术，面对“山重水复疑无路”的困境时，可以考虑通过新技术打开突破口。文中筛选SLERT相互作用蛋白的时候，鉴定到DDX21蛋白与SLERT有相互作用。研究背景表明DDX21调控rRNA转录是已经有报道的。2015年的Nature文章已经对此做了报道[3]。按照一般的思路，到此为止已经可以形成完整的故事了。反而想要进一步探索清楚相应的机制会面对很大的挑战和困惑。本文的作者们没有停在这里，而是借助超高分辨率显微镜技术找到了DDX21蛋白的特殊结构：DDX21蛋白聚集形成环状结构！这个有趣的发现大大提升了本文工作的新颖性，作者也进一步证实了SLERT对这种环状结构有调控作用，最终形成了本文的完整故事。从这一点，大家一定对拥抱新技术的威力有了深刻的认识了。科学研究的最大魅力在于对科学问题认识的不断深入，新技术能为我们带来探索和认识问题的新角度和新信息，或许能给所从事的研究带来“柳暗花明又一村”的惊喜。
（2）探索未知分子的功能需要秉持开放性思维。非编码RNA机制的研究经常给我们带来惊喜，包括本文在内，很多这方面的研究所揭示的机制模型都是全新的，这些模型当然不是作者天马行空乱想出来的，都是通过一步步实验和假设逐渐才揭示出来的。环状RNA的研究也需要这种精神，上个月集中报道的几篇关于环状RNA编码多肽或蛋白的文章就是典型。
附 陈玲玲教授简介：
陈玲玲
研究员，研究组长，博士生导师
个人简介：
2009年毕业于美国康涅狄格大学医学院获生物医学博士学位，同时获商学院工商管理学硕士学位。同年5月作为独立PI获得 Connecticut Stem Cell Seed Award研究经费资助，受聘于康涅狄格大学干细胞学院从事博士后研究，并于2010年5月任助理教授。2011年1月任上海生化与细胞所研究员。目前担任国际期刊Trends in genetics、Genome biology、Journal of Biological Chemistry编委。曾获全球华人生物学家协会(CBIS) 青年研究员奖、中国青年女科学家奖、亚太分子生物学联盟 (A-IMBN) 青年研究员奖、中国遗传协会李汝祺动物遗传奖、中国干细胞研究协会青年研究员奖等。
研究方向：长非编码RNA和干细胞
研究工作：
人类基因组测序计划发现多于98%的转录基因组序列为非编码RNA(ncRNA)。这些ncRNA包括人们所熟知的housekeepingncRNA(如tRNAs, rRNAs和snRNAs等)、小RNA(如miRNAs和piRNAs等)，以及上万条长非编码RNA(lncRNA，>200nt)。最近几年来的研究表明lncRNAs广泛参与一系列细胞的重要功能调控，包括细胞核亚结构的形成、基因表达的遗传与表观遗传调控等。
我们实验室主要研究哺乳动物细胞中lncRNAs的功能调控，包括新类型lncRNA分子的发掘、其加工成熟机制、以及它们在转录、染色体、细胞核亚结构和干细胞干性维持等方面的调控功能研究。未来五年，我们主要研究以下内容：
1、通过转录组测序和计算生物学手段结合的方法，发掘和鉴定人类基因组中的新类型lncRNA分子
2、利用分子生物学、细胞生物学和生物化学的手段，研究新lncRNA分子在基因表达调控中的作用机制
3、采用基因组编辑和活细胞成像等技术手段，研究lncRNA在细胞核亚结构和染色体维持和调控过程中的功能
4、以hESCs的多功能潜能性维持和分化为模型，研究lncRNA对人源胚胎干细胞的命运决定的调控
研究成果将能够丰富我们对lncRNAs功能和机制的认识，也为hESCs的多功能性维持和命运改变提供一个全新水平的调控。
参考文献：
1. Yu-Hang Xing, R.-W.Y., Yang Zhang, Chun-Jie Guo, Shan Jiang, Guang Xu, Rui Dong, Li Yang and Ling-Ling Chen, SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription. Cell, 2017. 169(4): p. 664–678.
2. Yang, L., et al., Genomewide characterization of non-polyadenylated RNAs. Genome Biol, 2011. 12(2): p. R16.
3. Calo, E., et al., RNA helicase DDX21 coordinates transcription and ribosomal RNA processing. Nature, 2015. 518(7538): p. 249-53.
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