环状RNA翻译蛋白研究技术思路剖析

原创 2017-03-30 句月山人 circRNA

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声明

近日接连发表了多篇环状RNA相关的高水平研究论文，报道发现了环状RNA翻译蛋白的现象，在环状RNA研究领域引起了不小的轰动。山人也为此非常振奋，编码多肽和蛋白将是环状RNA的重要功能模型，为环状RNA的研究开辟了重要的思路，必将大大推进环状RNA的研究。今天山人就和大家分享一下如何从零开始探索特定环状RNA是否表达多肽或蛋白及如何进行功能相关研究。注意：下面的表述中如无特定说明，环状RNA均指的是大家所感兴趣的特定环状RNA，非泛指。

环状RNA是否翻译蛋白及如何进行翻译蛋白的鉴定分析这个基本问题可以分为三个层次进行逐步深入分析：

（1）环状RNA的结构分析，分析环状RNA是否具有翻译蛋白的特征。
（2）人为设计载体分析和验证，针对所分析的环状RNA基本特征中关键位点进行突变验证。
（3）内源性翻译多肽或蛋白的鉴定与功能分析，找到內源性环状RNA翻译多肽或蛋白的直接证据并进一步研究其功能。

什么样的环状RNA可能翻译多肽或蛋白？
环状RNA翻译蛋白需要两个基本要素：翻译启动元件和阅读框。

翻译启动元件预测分析：
环状RNA没有游离的5'和3'端，因此如果可以进行翻译活动有一定是5'-帽子非依赖的方式进行的。目前已报道的环状RNA翻译蛋白的调控元件包括IRES和m6A修饰两种途径。

是IRES是internal ribosome entry site的简写，是一种具备募集核糖体并实现核糖体组装和后续阅读框翻译蛋白的RNA调控元件。IRES元件的预测可以用Chung-Yung Chen 2013年发表的一个在线工具VIPS预测IRES元件[1]。（网址： http://140.135.61.250/vips/）。

预测IRES的过程中用到了三个工具包：RNALfold (版本号2.1.9)、RNA Align (VIPS数据库开发者开发的)及pknotsRG (版本号 1.3) 。

也可以用IRESite数据库进行分析（http://iresite.org/）。该数据库收集了已发表的IRES元件序列，可以通过目标序列与数据库中序列进行比对分析，评价作为IRES元件的可能性[2]。

前不久中科院上海计算生物学研究所王泽峰教授在线发表的Cell Research文章介绍发现机遇m⁶A修饰的环状RNA翻译蛋白机制[3]。细胞中m⁶A修饰的修饰酶包括METTL3/METTL14-WTAP，去修饰酶包括FTO，ALKBH5。m⁶A修饰存在保守性序列，典型的为GAC或AAC motif中的A碱基，总结而言，m⁶A修饰相关的motif为：“RRm⁶ACH” (R = G or A; H = A, C or U)[4]。在细胞内，m⁶A修饰主要由YTH domain家族蛋白识别，包括YTHDF1, YTHDF12 和YTHDF13[5]。在Cell Research文章中王教授给出的m⁶A修饰调控环状RNA翻译的机制是：由METTL3/METTL14-WTAP丹巴复合物进行m⁶A修饰，FTO进行m⁶A去修饰调控。含有m⁶A修饰的位点通过募集YTHDF3进而募集eIF4G2，进而启动蛋白翻译过程[3]。这些研究背景对我们分析环状RNA通过m⁶A修饰途径翻译多肽或蛋白非常有帮助。

图1 m⁶A修饰调控环状RNA翻译的机制（来自[3]）

阅读框预测：

阅读框是Open Reading Frame的简写，指在核酸序列中从ATG开始（RNA中为AUG），三个碱基为一组，直至TAA，TAG或TGA（RNA中A变为U）终止密码子的序列。阅读框的分析相对简单，有多种工具可已选择，包括常用的序列分析软件都自带ORF分析预测功能。

载体表达验证实验：

预测分析了环状RNA可能具有翻译蛋白的功能后首先需要通过构建载体进行验证。这其中包括针对翻译启动元件是否发挥功能的验证实验和阅读框翻译产物的验证实验。

元件突变实验比较容易理解，就是把预测的IRES或m⁶A修饰位点给突变掉，看后续的翻译活动是否还能顺利进行。

阅读框更换实验目前有两种构建思路：

（1）在原有阅读框的前端增加标签序列，包括3×Flag等标签。

（2）用报告基因替换原有阅读框，包括荧光素酶报告基因或荧光蛋白报告基因等。

两种实验往往同步设计进行。主要目标就是论证所预测的翻译启动元件和阅读框产物在生理条件下是否可以实现。

内源性翻译产物验证与功能研究：

内源性的环状RNA翻译产物鉴定和功能研究是整个研究思路中最重要的部分。包括内源性翻译产物鉴定，核糖体结合验证，翻译产物过表达和敲低（或敲除）实验。

内源性翻译产物鉴定：

內源翻译产物鉴定就是要证明在所研究的材料中天然存在预测的翻译产物。目前这方面的研究思路首选是通过制备特异性的抗体进行Western等检测实验。这部分需要注意保证所制备的抗体的特异性，因此需要有抗体特异性的证明实验，具体包括模拟翻译产物的过表达和敲除实验等等。得到了特异性高的抗体后，一方面可以通过Western实验进行杂交实验，还可以通过IP后进行质谱鉴定。质谱鉴定实验需要提前制备化学合成的靶分子多肽获得标准化图谱，然后在IP产物的质谱分析中找出与标准化图谱一致的肽段。

还有一种鉴定内源性产物的技术策略就是基于基因组改造。目前基于CRISPR体系的基因组定向改造技术日臻成熟，完全有条件获得目标序列插入、缺失、突变等不同形式的基因改造细胞。在这些细胞中设计相应的验证实验也是验证内源性翻译产物的重要实验。

核糖体结合分析：

是否有核糖体结合在环状RNA上也是是否进行翻译活动的重要实验证据。目前已有比较成熟的基于蔗糖密度梯度离心的核糖体分离技术。在所获得样品中鉴定是否有我们感兴趣的环状RNA存在。一些工具药有助于增加这个实验的成功率，如嘌呤霉素。

翻译产物过表达和敲低（或敲除）实验：

这个实验比较容易理解，就是构建过表达或敲低/敲除的体系，看不同含量的翻译产物对细胞生理指标的影响情况。其中过表达可以设计基于常规表达载体的体系，也可以是环状RNA产物形式。

此外，还可以通过常用的多肽或蛋白信息学分析技术对其进行一些主要信息的分析预测，也可以借助所制备的抗体进行细胞定位，修饰，生成与降解动力学以及相互分子的分析等工作。

最后，Granados-Riveron, J.T.曾在2016年撰写过综述文章汇总了环状RNA可能翻译多肽的研究进展[6]，其中汇总了几个比较有用的在线工具：ORF Finder：可用于分析核酸序列中可能存在的ORF。IRESite可用于分析目标序列中可能存在的IRES元件。CPAT可用于评估RNA编码多肽的可能性。Pfam 29.0可用于评估预测的多肽序列的基本特征。PhyloCSF可用于相关的进化分析。CircInteractome可用于分析目标环状RNA相互作用的miRNA或蛋白及其作用位点。这些工具也对大家研究有所帮助。

图2 有用的预测分析环状RNA表达多肽的工具（来自[6]）

总之，翻译多肽是环状RNA非常重要的功能模型，为环状RNA的功能研究提供了非常有价值的思路。相信后面还会陆续有更多的类似的文章发表出来。希望我总结的这些研究思路能对大家的研究设计有所帮助。

参考文献：

Hong, J.J., et al., Viral IRES prediction system - a web server for prediction of the IRES secondary structure in silico. PLoS One, 2013. 8(11): p. e79288.
Mokrejs, M., et al., IRESite--a tool for the examination of viral and cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res, 2010.38(Database issue): p. D131-6.
Yang, Y., et al., Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Res, 2017.
Harper, J.E., et al., Sequence specificity of the human mRNA N6-adenosine methylase in vitro. Nucleic Acids Res, 1990. 18(19): p. 5735-41.
Meyer, K.D. and S.R. Jaffrey, The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014. 15(5): p. 313-26.
Granados-Riveron, J.T. and G. Aquino-Jarquin, The complexity of the translation ability of circRNAs. Biochim Biophys Acta, 2016.1859(10): p. 1245-1251.