circRNAs过表达载体构建策略篇
声 明
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circRNAs作为新兴的明星分子，越来越多的环状RNA（circRNAs）研究被报道，发现circRNAs参与了众多病理生理过程，发挥及其重要的生物学功能。进一步采用合适的技术手段深入研究circRNAs的作用机制显得非常重要，本文从circRNAs过表达角度介绍构建circRNAs过表达载体的主要3种策略，为研究circRNAs功能研究提供参考。
1 环状RNA过表达的3种方案
1.1 模拟內源环化模式的通用成环框架载体
吉赛生物专利技术的通用成环框架载体，基于模拟内源性的环化模式开发，使用上游和下游两个框架促使插入的环状RNA序列成环和剪切。框架序列包括一段反向互补序列和促环化剪切的介导序列，整体框架可使插入的环状RNA序列高效率环化，并精确地在AG-GT位点严格剪切。
优点：
1）通用性强。仅使用同一个载体可对研究的目标环状RNA构建过表达载体，适用于大批量研究。
2）克隆载体构建简单。实验只需以PCR扩增目的环状RNA线性序列，经过酶切连接到载体上，简单快捷。
3）环化效率高。过表达载体转染后做qPCR检测，视不同的基因和实验操作，实际测试可过表达几十倍到数千倍。
4）环化准确。以Divergent Primer检测，PCR产物测序确认，无碱基添加或缺失。
不足：对于极个别序列特殊，二级结构稳定复杂的环状RNA，可能无法准确环化过表达；对于非AG-GT剪切成环模式的环状RNA，可能无法准确环化过表达。
1.2 简化的天然成环框架载体
参考使用文章（Liang et al.,2014）提供的简化的天然成环框架载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector。该载体基于circ- ZKSCAN1的侧翼序列，分析特征并简化Alu序列，最终使用pcDNA3.1(+)构建一个通用载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector，载体预留酶切位点供替换克隆环状RNA。其框架和酶切位点序列如下：
gaattcaaagtgctgagattacaggcgtgagccaccacccccggccCACTTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGGATATCATCGATACCGGTTTAATTAACACGTGGGTAACCGTTAACCCGCGGAGGTAAGAAGCAAGGAAAAGAATTAggctcggcacggtagctcacacctgtaatcccagcagcggccgc
考虑到酶切位点对准确成环的影响，避免过表达环状RNA成环后错误加入酶切位点或部分框架序列，可以使用该框架构建无缝克隆载体，在AG-GT间直接插入目的环状RNA序列，去掉酶切位点。框架序列如下，N为替换的目的环状RNA序列：
aaagtgctgagattacaggcgtgagccaccacccccggccCACTTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAAGAAGCAAGGAAAAGAATTAggctcggcacggtagctcacacctgtaatcccagca
以我们的测试结果来看，使用载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector的酶切位点克隆环状RNA，过表达成环后有检测到错误加入酶切位点的情况，所以推荐使用该框架做无缝克隆载体。
优点：
1)环化效率高。过表达载体转染后做qPCR检测，视不同的基因和实验操作，实际测试可过表达几十倍到上千倍。
2)使用pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector构建克隆载体，只需以PCR扩增目的环状RNA序列，经过酶切连接到载体上，简单快捷。
不足：
1）使用载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector的酶切位点克隆环状RNA，错误环化率高，成环后环状RNA序列内错误加入酶切位点。
2）通用性有限。该载体框架不能介导所有插入的环状RNA序列准确环化过表达，长度低于200bp或者长度大于1000bp的环状RNA有较大可能无法介导环化。
3）若使用该框架构建无缝克隆载体，则需要分段合成上下游框架序列和目的环状RNA序列，成本和构建周期都会偏长。
4）对于部分序列特殊，二级结构稳定复杂的环状RNA，可能无法过表达环化。
5）对于非AG-GT剪切成环模式的环状RNA，可能无法过表达环化。
1.3 基因特异的侧翼序列载体
基于环状RNA的侧翼序列特征，克隆其侧翼重复序列（Alu元件）和环状RNA序列，以PCR分段扩增目的环状RNA的侧翼上下游各200-1000bp序列和环状RNA序列，构建到真核表达载体上。
优点：
环化准确。基因特异的天然侧翼序列中含有环化和正确剪切的序列元件，其过表达出错的可能性较小。
不足：
1）侧翼序列长度无界定标准。环状RNA侧翼存在的重复序列如Alu元件，距离环状RNA的距离不等，需要克隆的片段长度不一。
2）侧翼序列特征不明确。环状RNA侧翼序列内起引导环化的片段和识别引导正确剪切的片段未知，过表达的有效性和效率较难预测。
3）过表达效果较难预测。按经验克隆的侧翼上下游各200-1000bp序列，若没有包含重复序列，可能无法介导过表达环化。若包含多个重复序列元件，可能非特异地介导同一pre-mRNA来源的其他环状RNA过表达环化。
4）载体构建复杂。以gDNA为模板分段克隆环状RNA侧翼序列的上游和下游，以cDNA/gNDA为模板扩增环状RNA序列，再以Overlapping PCR或同源重组拼接获得侧翼序列上游+环状RNA+侧翼序列下游完整片段，然后克隆到真核表达载体上。其PCR和克隆步骤繁琐，载体构建周期长，若完整克隆片段过长也容易引入突变。
5）无通用性。侧翼序列为基因特异的，每个环状RNA都需要分别克隆其上下游的侧翼序列。
2 一组瓶颈数据
在实际的研究中进行环状RNA过表达实验，可根据需要和实验条件自由选用以上三种方案，通用的框架载体是首选方案，而对于序列复杂的环状RNA，若不能成功过表达，则可使用第3种方案。吉赛生物内部实际测试结果显示，通用的框架载体并不能对100%的环状RNA成功过表达，考虑到內源性环化模式多样化也较为复杂，通用的框架载体不能对全部环状RNA有效也是可以预料的结果。三种方案的成功率可参考以下数据。
方案1：吉赛生物专利技术的框架载体pCD-ciR、pCD2.1-ciR、pLO-ciR、pLCDH-ciR。截止到2017年3月1日，吉赛生物已用这四个载体构建超过1000个环状RNA过表达载体，其中约450个经瞬时转染或包装慢病毒感染后进行qPCR检测过表达，发现有三个基因无法成功准确环化过表达，三个基因分别是has_circ_00085154、has_circ_0005927、has_circ_0001073，可以粗略地估算到方案1的成功率不低于99%。
方案2：文章里提供的简化的天然成环框架载体。截止到2017年3月1日，吉赛生物使用该框架载体构建四个环状RNA过表达载体，其中三个无法成功过表达，三个基因分别是has_circ_0001073、has_circ_0000284、has_circ_0082002，其中has_circ_0001073和has_circ_0082002在使用带酶切位点的载体和不带酶切位点的无缝克隆框架载体时，都不能准确过表达。
方案3：基因特异的侧翼序列载体。使用基因自身含重复序列（Alu原件）的侧翼序列构建载体，截止到2017年3月1日，吉赛生物使用此方案构建三个环状RNA过表达载体，三个都可以准确环化过表达。
吉赛生物在环状RNA过表达载体上有着丰富的研发经验，如果您在研究中也发现不能成功过表达的环状RNA，可向我们报告，我们将免费为您评估，设计合适的方案。
购买了吉赛生物的空载体自行构建的研究者，若碰到不能正确过表达的环状RNA，请立即联系我们，我们将为您免费评估，设计合适的替代方案，全程为您的实验提供必要的咨询服务。
也欢迎研究者关注“circRNA”微信公众号和QQ交流群171451123，我们将定期更新环状RNA研究的最新进展，发布实验技术经验分享。
参考文献：
1.Liang D, Wilusz JE. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes Dev. 2014;28:2233–2247.
2.Jeck WR, Sorrentino JA, Wang K, Slevin MK, Burd CE, Liu J, et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 2013;19(2):141–57.
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