Cas9同源蛋白Csy4促进环状RNA生成

声    明

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        2月21日，RNA杂志在线发表了北卡大学教堂山分校Aravind Asokan教授为通讯作者的文章，介绍开发了一种基于CRISPR同源蛋白Csy4的促进RNA环化的技术(Borchardt et al., 2017)。

        Csy4是CRISPR家族的一个Cas-9的同源蛋白，有时也被称为Cas6f，具有核酸内切酶的功能，在将RNA分子切割后可使5’端切割后的产物更稳定。基于这一特性，作者设计了一种表达环状RNA的体系，概括而言，就是在内含子中插入Csy4的识别序列，共表达Csy4后该序列下游的RNA序列被切割后降解掉，上游的序列得以稳定存在，促进了环化效率(Borchardt et al., 2017)。该方法或许有助于提高环状RNA表达的效率和特异性，减少线性RNA副产物。值得引入环状RNA过表达体系中。

1. 报告系统设计：

        在普通的环状RNA表达载体（文中称为circGFP载体）中设计环化后形成完整GFP阅读框，中间加上IRES元件（一种哺乳动物细胞中有效的核糖体募集元件，能促进下游的阅读框翻译），当RNA发生环化后就能翻译出GFP蛋白。文中为了验证Csy4促进RNA环化的作用，在普通环状RNA表达载体的下游加上了Csy4元件，后面加P2A元件和dsRed报告基因（文中称为circGFP-CD载体）。如果转录的RNA能被Csy4识别，dsRed就会被切掉，而只表达GFP，如果不能正确行使功能，dsRed就可以被翻译出来。借助荧光显微镜分析GFP和dsRed信号就可以做出准确的判断(Borchardt et al., 2017)。

图1 Csy4可以结合在RNA3’端并稳定RNA分子，促进环状RNA的生成。（来自(Borchardt et al., 2017)）

2. 共表达Csy4后报告系统迅速转换为GFP信号

        circGFP载体能正常表达GFP，circGFP-CD载体则可以顺利表达dsRed信号。但共表达Csy4之后，dsRed信号就会衰弱直至消失（转然后72h）。Csy4-H29A突变体没有这一作用。对拍摄的图片进行信号分析结果表明野生型Csy4极大程度促进了RNA产物的环化，Csy4-H29A突变体则没有这一功能。

图2 Csy4促进RNA产物环化（来自(Borchardt et al., 2017)）

3. PCR和Southern实验验证了Csy4促进RNA产物环化的作用

        为分析不同RNA产物的情况，作者分别借助RT-PCR和Southern实验分析了各种RNA产物的情况，结果表明Csy4能大大促进RNA产物的环化效率。

图3 各种RNA转录后加工状态的分析（来自(Borchardt et al., 2017)）

4. 定量PCR结果支持Csy4促进RNA产物环化的结论

        进一步，作者也利用了QPCR的方法定量分析了Csy4对RNA产物环化效率的影响。结果支持Csy4促进RNA环化的结论。

        本文的工作非常简单，但非常有用。Csy4极大程度促进RNA环化效率，或许对一些环状RNA过表达的实验有所帮助，建议大家将该基因用于所进行的过表达实验中。

        文中所用的Csy4基因基本信息：基因来源于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，基因组编号：UCBP-PA14）; NCBI Gene ID: 18072841; Location: NC_023149.1 (3034357..3034920, complement).

扩增引物：

5’-ATCGTCTAGAATGGACCACTACCTCGACATTCGCTTGC-3’ 

5’-CGATGCGGCCGCTCAGAACCAGGGAACGAAACCTCCTTTGC-3’

参考文献：

Borchardt, E.K., Meganck, R.M., Vincent, H.A., Ball, C.B., Ramos, S.B., Moorman, N.J., Marzluff, W.F., and Asokan, A. (2017). Inducing circular RNA formation using the CRISPR endoribonuclease Csy4. Rna.

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