重磅：m6A修饰促进环状RNA翻译

声    明

欢迎个人转发到朋友圈，公众号、自媒体、网站等媒体转载请联系授权，[e-mail]。

        3月10日，Cell Research杂志在线发表了中科院上海计算生物学研究所王泽峰教授为通讯作者的研究论文，介绍发现了环状RNA中m⁶A修饰，并且该修饰能促进环状RNA翻译。陈玲玲教授为共同作者。记得2016年年底的年度进展总结的时候，山人就曾列举过环状RNA还没有比如m⁶A之类的化学修饰的报道，现在得到确证了[4]。王教授的这一研究报道是环状RNA研究的重大进展。下面我们就一起分享一下这篇文章吧：

什么是m⁶A修饰？有什么作用？
        m⁶A修饰是RNA中存在的一种碱基化学修饰方式，参与调控了RNA许多重要功能。m⁶A全称是N⁶-methyladenosine，就是在RNA分子的A碱基第六位的N元素上加上一个甲基基团的修饰方式，见下图：

图1 RNA中m⁶A修饰（来自[1]）

    细胞中m⁶A修饰的修饰酶包括METTL3/METTL14-WTAP，去修饰酶包括FTO，ALKBH5。m⁶A修饰存在保守性序列，典型的为GAC或AAC motif中的A碱基，总结而言，m⁶A修饰相关的motif为：“RRm⁶ACH”(R=G or A; H=A, C or U)[2]。m⁶A修饰的去修饰过程呈现组织和细胞特异性特征[3]。

图2 m⁶A修饰酶和去修饰酶（来自[3]）

        m⁶A修饰是RNA的一种重要的修饰方式，已报道的与其有关的生理病理行为包括肥胖，胚胎发育，神经突触信号传递，肿瘤，精子发育等等[3]。分子层面，m⁶A修饰主要参与调解RNA-蛋白相互作用，RNA二级结构稳定性，RNA剪接，翻译调控及RNA分子稳定性调控[3]。在细胞内，m⁶A修饰主要由YTH domain家族蛋白识别，包括YTHDF1, YTHDF12 和YTHDF13[3]。

图3 m⁶A修饰的主要分子生物学功能（来自[3]）

携带m6A修饰motif的环状RNA也可以在细胞内翻译多肽

        脑补完m⁶A修饰的基本知识后，现在一起来看看这篇文章是怎么做的吧。在早期的研究中就曾有报道在环状RNA中发现存在IRES元件，也有一些线索显示这些IRES元件可以促进后面的阅读框翻译。本文作者在早期也是为了验证这一现象，但遇到了一个非常奇怪的现象：在IRES阴性对照组也能翻译！

        作者选择了三种来源的IRES序列（IGF2、 Hsp70 和 XIAP），三个IRES阴性对照（短内含子序列，编码区及beta-Actin基因的5′UTR）。从Western的结果来看，这六组实验组全部可以翻译出GFP蛋白质！

图4 GFP报告系统发现非IRES起始的环状RNA翻译活动（来自[4]）

        面对这样困惑的现象，作者尝试分析了这些报告系统中是否存在m⁶A修饰的可能。经过序列分析，确实在所设计的三个对照组报告基因载体中存在m⁶A修饰motif。并且，当将这些关键位点做突变后GFP的翻译活动就受到了严重的影响，直至完全消失。因此m⁶A修饰在环状RNA的翻译活动中的重要性就初步得到证实了。

图5 m⁶A修饰相关motif促进环状RNA报告基因的翻译（来自[4]）

环状RNAm⁶A修饰水平影响其翻译效率
        上面的实验仅仅证明了m⁶A修饰相关motif与环状RNA翻译调控的关系，还需要直接证明环状RNA中的m⁶A修饰对其翻译作用有直接的影响。为此，作者构建了验证体系，作者用到了m⁶A的抗体基因RNA Pull Down。选择携带RSV m⁶A site的SON mRNA作为阳性对照，载体中分别构建RSV m⁶A site和突变对照（如下图）。抗体IP后分析钓取的RNA分子的丰度，结果表明环状RNA载体携带野生型的RSV m⁶A site的载体钓取后丰度远高于突变型的，表明环状RNA确实可以携带m⁶A修饰。FTO是m⁶A的去修饰酶，IP实验也表明共表达FTO后IP产物迅速减少。结合Western实验，可以证明所设计的载体中m⁶A修饰是客观存在的，并且会因为FTO共表达而大大降低翻译GFP的效率。

图6 m⁶A修饰可存在于环状RNA上且调控其翻译（来自[4]）

        反过来，m⁶A修饰是由哪种酶介导完成的呢？于是作者利用相同的体系验证了共表达METTL3和METTL14后IP和Western的情况。结果表明METTL3和METTL14介导了环状RNA载体的m6A修饰，且与GFP报告基因的翻译有关。

图7 METTL3和METTL14介导了环状RNA的m6A修饰并调控其翻译（来自[4]）

        之前的研究报道表明，热休克刺激下m⁶A修饰可促进蛋白翻译。因此作者也分析了热休克刺激对环状RNA受m⁶A修饰调控翻译的作用。结果表明m⁶A修饰会随着热休克刺激的持续而持续促进环状RNA的翻译活动。

图8 热休克刺激促进m⁶A修饰调控的环状RNA翻译活动（来自[4]）

eIF4G2参与m⁶A修饰调控的环状RNA翻译活动
        上面的实验已经证明了m⁶A修饰可以调控的环状RNA翻译，那么这个活动是如何起始的？真核生物常规的蛋白翻译起始由eIF4复合物开始，其中的eIF4E结合5’帽子结构，eIF4G提供翻译起始复合物组装所需的支架，募集核糖体后起始翻译过程。在不依赖5’帽子结构的翻译起始机制中，eIF4G2直接识别IRES元件，进而促进eIF4复合物组装，不需要eIF4E参与。

图9 蛋白翻译起始基本机制（来自[4]）

        进一步，作者分别在稳定表达eIF4G2或eIF3A的干扰RNA的293稳定细胞株中分析m6A修饰调控的环状RNA翻译活动影响情况，结果表明eIF4G2和eIF3A参与了该过程。作者还在进一步分析了ARIH2基因环状RNA中eIF4G2与eIF3A结合位点及m6A修饰位点的情况。结果表明eIF4G2与eIF3A结合位点与m6A修饰位点重合较高。

图10 eIF4G2和eIF3A参与m⁶A修饰调控的环状RNA翻译活动（来自[4]）

内源性环状RNA存在m⁶A修饰
        到该阶段，几乎所有的实验几乎都是基于外源设计的载体系统进行的，那么内源性的环状RNA中m⁶A修饰的情况如何呢？作者设计基于m⁶A抗体IP后深度测序的方法分析内源性带m⁶A的环状RNA（circRNA-m6A-seq）。测序后鉴定到85种环状RNA，选择了8种进行QPCR验证。进一步的序列特征分析表明，m⁶A修饰motif经常出现在eIF4G2结合位点的上游，说明这两者可能存在协同调控翻译活动作用。基于m⁶A抗体IP测序组和对照全部环状RNA的数量，作者分析到大约13%的总环状RNA存在m⁶A修饰。

图11 细胞内源性环状RNA存在m⁶A修饰 （来自[4]）

内源性环状RNA翻译多肽的情况可能是普遍存在的现象
        基于上述发现，作者设计了一个分析预测环状RNA存在m⁶A修饰并翻译蛋白的流程。作者在Hs68细胞经过Rnase R消化后测序获得的总环状RNA（7771种），分析到623种可能存在m⁶A修饰，其中124种携带翻译起始元件（TIS），最终其中携带超过150bp ORF的为25种。最后，基于多核糖体谱分析验证，所选的25个circRNA中12个测试后表明其中的10个确实存在多核糖体谱阳性信号证据。

图12 内源性环状RNA翻译多肽的验证（来自[4]）

        反过来，作者也从核糖体结合的RNA样品深度测序中找到了环状RNA的证据。首先通过蔗糖密度梯度离心后分离核糖体，进而分离所结合的RNA，RNase R消化后建库测序，分析其中的RNA序列情况。共找到了250种环状RNA。这个过程作者用了非常严苛的实验筛选条件，只选择了存在多个核糖体结合情况的。这些结合多个核糖体的环状RNA表现出两个特征：较少较短的外显子序列，较长的预测ORF（均相对于总环状RNA而言）。嘌呤霉素和环己酰亚胺处理实验也表明这些结合的核糖体确实正在进行翻译活动。

图13 内源性环状RNA翻译多肽的系统性分析（来自[4]）

细胞内源性环状RNA翻译多肽的系统分析
        作者接下来分析了数据库中环状RNA翻译多肽的线索证据并进一步在细胞中验证。作者首先基于CircBase数据库分析了可能由环状RNA表达的多肽信息，并进一步在UniProt数据库中的293全细胞来源样品的串联质谱数据，作者从中找到了33条质谱数据记录（对应于19种多肽）可能与预测的环状RNA翻译多肽吻合。作者还通过化学合成该肽段重新进行串联质谱分析，以验证所选取的质谱峰图的可靠性。

图14 细胞内源性环状RNA翻译多肽的质谱验证（来自[4]）

        最后，本文首次系统证明了环状RNA表达多肽的现象，尤其是基于m6A修饰的环状RNA其实翻译的发现，大大推进了环状RNA功能的研究。环状RNA中m6A修饰的发现也填补了该方向的空白。

图15 m⁶A修饰调控环状RNA翻译（来自[4]）

参考文献

1. Chandola, U., R. Das, and B. Panda, Role of the N6-methyladenosine RNA mark in gene regulation and its implications on development and disease. Brief Funct Genomics, 2015. 14(3): p. 169-79.
2. Harper, J.E., et al., Sequence specificity of the human mRNA N6-adenosine methylase in vitro. Nucleic Acids Res, 1990. 18(19): p. 5735-41.
3. Meyer, K.D. and S.R. Jaffrey, The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014. 15(5): p. 313-26.
4. Yun Yang, et al., Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Research, 2017, 10 Mar, Published On line.

近

期

热

文

circRNA

最新研究进展  分享科研干货

环状RNA交流群

分享研究技巧  经验交流平台

点击“阅读原文”