外泌体技术研究路线

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声 明

        2013年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯·罗思曼、兰迪·谢克曼以及德国科学家托马斯·祖德霍夫，以表彰他们发现细胞的囊泡运输调控机制。

获奖现场

        这三位科学家的研究成果解答了细胞如何组织其内部最重要的运输系统之一——囊泡传输系统的奥秘。外泌体因诺贝尔医学奖而被众人知晓，也因其作为生命信息传递者，在体液中广泛存在及易获得性等特点被誉为液体活检"新贵"，成为疾病的精确诊断和治疗研究的热点，尤其是在肿瘤研究领域[1]。

        外泌体作为细胞间通信载体的作用现在已被普遍接受。外泌体包含胞质环境中富含的DNA，RNA，蛋白质和其它分析物，研究表明，外泌体中的运转RNA和蛋白质与肿瘤的生长密切相关，有望作为诊断标志物。从外泌体相关的已发表的高分文章来看，外泌体研究有类似的研究路线和方法，现分享给大家，望有助于各位专注于外泌体研究的科研工作者。  

分享一

Keyword：Liver cancer  exosome  miRNA  Tumor inhibition

Title：Vps4A functions as a tumor suppressor by regulating the secretion and uptake of exosomal microRNAs in human hepatoma cells[3]

Journal：Hepatology

Impact factor：11.29

文献概要：

        目的是研究外泌体介导的microRNA的调控机制，第一步通过microRNA表达谱的检测分析来源于肝癌细胞的外泌体。第二步，应用肝细胞和外泌体共培养实验得出以下结论：来源于肝癌细胞的外泌体能促进肝癌细胞的生长及迁移侵袭，且外泌体有运输microRNA至受体细胞的功能。第三步，研究发现Vps4A是一个外泌体的重要调控因子，与肝癌的发生有着密切的关系，Vps4A基因的表达下调肝癌的发生及转移相关。通过microRNA高通量测序发现Vps4A基因能导致外泌体分泌肝癌相关的重要microRNA，与肝癌的发生密切相关。

结论：

        本文阐释了肝癌细胞通过外泌体传导miRNAs进行自调节的重要机制，进一步的研究表明Vps4A基因可能利用外泌体途径调控肝癌相关重要miRNAs的分泌和摄取，抑制肿瘤的发展，为肝癌的形成机制提供了新的研究思路。

研究线路：

结果显示：

1. 通过高通量测序分析肝癌细胞及其外泌体，证实外泌体能选择性包容microRNA。

        分别对肝癌细胞系及其分离出来的外泌体进行Small RNA高通量测序，结果显示：microRNA-423-5p 、microRNA-21-5p在肝癌细胞系及其外泌体中均有表达，let-7d-5p, let-7b-5p, let-7c-5p在肝癌细胞高表达，而在外泌体中低表达；相反： microRNA-486-5p、microRNA-10b-5p在肝癌细胞外泌体中高表达，而在肝癌细胞中低表达。

图1A SMMC-7721细胞分泌的外泌体电镜图片；图1B 外泌体标记蛋白western blot鉴定图

2.肝细胞和外泌体共培养实验得出外泌体有运输microRNA至受体细胞的功能。

        Hep3B 和SMMC-7721细胞与其细胞系分离出来的外泌体进行共培养，证实：来源于肝癌细胞的外泌体能促进肝癌细胞的生长及迁移侵袭；通过荧光标记的技术手段，可观测到外泌体能将microRNA运输至受体细胞中（如图1C）。

图1C 荧光标记外泌体microRNANA入侵受体细胞

3.通过microRNA高通量测序发现Vps4A基因能导致外泌体分泌肝癌相关的重要microRNA。

        microRNA高通量测序发现过表达Vps4A的肝癌细胞稳定株的外泌体中癌症相关的两个重要microRNA(microRNA-27b-3p 、 microRNA-92a-3p) 高表达（图2A）；而Vps4A的肝癌细胞稳定株中发现三个癌症相关的两个重要microRNA (microRNA-193a-3p, microRNA-320a, microRNA-132-3p)高表达（图2B）。 证明： Vps4A基因可促进外泌体分泌癌症相关的microRNA。

图2 microRNANA表达差异图

实验样品选择：SMMC细胞-ctrl VS SMMC细胞-Vps4A,  SMMC-ctrl-exo VS SMMCV-ps4A-exo，microRNANA显著差异表达分析（表达量超过200，FDR <0.05, 差异为1.5倍）。

分享二

Keyword：prostate cancer  exosome  biomarker

Title：Exosomal miR-1290 and miR-375 as prognostic markers in castration-resistant prostate cancer [2]

Journal：EUR UROL

Impact factor：14.976

文献概要：

        目的是研究外泌体中的microRNA能否对前列腺癌患者的预后情况进行评估，首先通过对多个前列腺患者的血浆外泌体进行高通量测序，分析得到miR-375和miR1290有显著的差异表达，并与前列腺癌预后有显著关联。然后通过QPCR的方法对高通量测序结果进行验证。为前列腺癌的诊断标志物研究提供新的论据。

研究线路：

结果显示：

        1. 通过外泌体高通量测序数据分析发现已知的microRNA 375个，未知的microRNA 57个；选择稳定表达的micorRNA-30a-5p和micorRNA-30e-5p作为定量PCR检测验证的内参。

        2.高通量测序分析出差异表达基因中，通过QPCR方法验证得到生存相关性的三个microRNA(microRNA-1290、microRNA-1268和microRNA-375)。其中microRNA-1290和microRNA-375与前列腺病人生存周期相关。通过临床预后模型分析miR-1290和miR375，发现这两个血浆外泌体的microRNA可作为去势抵抗性前列腺癌病人有效预后监测的分子标记物。

图3 外泌体RNA种类及含量分布图

图4 Kaplan-Meier存活函数法分析

（a）及Multivariate-based生存分析；（b）发现miR-375和miR-1290miRNA表达与预后存活显著相关。

        吉赛生物已突破外泌体研究的多个瓶颈（如血清血浆、细胞上清、体液等外泌体分离提取、外泌体RNA提取及其NGS文库构建），实现外泌体高通量测序，并提供深度的测序数据分析。为您探索外泌体内环状RNA、microRNA、mRNA、LncRNA及其内在联系提供完整的解决方案。

吉赛生物为您提供发表高分文章的答疑、技术分析。

官方网站：www.geneseed.com.cn

咨询电话：400-8989-400

参考文献

1. Becker A, Thakur BK，et al. Extracellular Vesicles in Cancer: Cell-to-Cell Mediators of Metastasis. Cancer Cell. 2016 Dec 12;30(6):836-848

2.Huang X, Yuan T，et al. Exosomal miR-1290 and miR-375 as prognostic markers in castration-resistant prostate cancer.Eur Urol. 2015 Jan;67(1):33-41.

3. Wei JX, Lv LH, et al. Vps4A functions as a tumor suppressor by regulating the secretion and uptake of exosomal microRNAs in human hepatoma cells. Hepatology. 2015 Apr;61(4):1284-94. 

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