运动神经元中FUS介导环状RNA形成

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声 明

        3月30日，Nature Communication杂志在线发表了罗马萨皮安扎大学Mariangela Morlando教授和意大利技术研究所Irene Bozzoni教授为共同通讯作者的文章，介绍发现RNA结合蛋白FUS在神经元中介导RNA反向拼接活动，与环状RNA的形成有关[1]。

FUS基因

        FUS蛋白是一种RNA结合蛋白，已报道参与调控RNA的剪接作用。已有研究报道表明FUS基因的C-端突变会改变该蛋白的亚细胞定位，导致细胞核内减少而胞质能增多，形成聚集体，最终导致ALS等神经系统疾病。

本文的思路与结论

        FUS是RNA结合蛋白，还参与RNA剪接作用，那么FUS会不会参与神经系统的环状RNA生成呢？本文正是围绕这一问题开展的。作者采用体外分化的运动神经元作为研究对象，构建了FUS基因敲除株，分析了FUS基因敲除前后分化的运动神经元中环状RNA的变大差异，结合对应线性RNA的变化比例和测序丰度，最终找出了19种环状RNA，进一步在胚胎干细胞和分化的运动神经元中分析其表达状态，也在人的ES和运动神经元中进行了验证。接下来，作者在Neuro-2a细胞中进行RNA干扰实验和各种突变型诱导表达分析，最终证明FUS蛋白与环状RNA的形成有关，FUS是通过结合外显子/内含子边界参与环状RNA的形成过程的。

小鼠胚胎干细胞（mES）诱导分化的运动神经元（MN）中环状RNA表达情况

        作者采用小鼠mES分化MN的模型进行该项研究，构建了FUS敲除株和分化后MN特异性GFP基因标记（Hb9::GFP，分化成功的运动神经元才能发出绿色荧光）。基于这一体外模型，比较了FUS敲除前后环状RNA的变化情况，进行了三次生物学重复。

图1 FUS基因敲除后运动神经元中环状RNA表达发生变化（来自[1]）

FUS基因敲除改变环状RNA表达状况

        在上述模型中作者分析了环状RNA与所对应的线性RNA的变化情况，筛选到了136种有变化的环状RNA，其中111种为下调。但这其中有两个环状RNA的线性RNA变化也非常明显，这种改变可能是转录水平的改变引起的，因此接下来的分析中将其暂时排除。剩下的134种环状RNA再依据表达量的状况，过滤掉在6组测序样品数据中Reads少于2个的，这样剩下的是21种。然后经过RNase R消化实验，又有两种对RNase R敏感，也排除掉。剩下的19种环状RNA进行了定量PCR验证。作者在RT-PCR中也遇到了PCR产物有多条带的情况，怀疑是滚换反转录的结果，于是挑选了两个进行胶回收验证，测序结果证明所推测的属实。

图2 筛选到的环状RNA定量PCR验证（来自[1]）

        为进一步分析这些候选环状RNA与运动神经元的相关性，作者继续在mES和MN中分析了它们的表达情况，结果表明有的circRNA在mES中就有表达，有9种环状RNA在分化的MN中明显高表达。作者还在人的ES分化MN模型中进行了验证实验。

图3 MN特异性的环状RNA验证（来自[1]）

FUS基因敲除或突变影响环状RNA的生成

        为进一步研究FUS与环状RNA生成的关系，作者选用了Neuro-2a (N2a)细胞进行分子实验。在N2a细胞中，19种环状RNA只有一种没有检测到。通过分离细胞质和细胞核组分分析细胞定位，结果表明绝大部分环状RNA定位于细胞质，但有3个是主要定位于细胞核内，这些定位于细胞核的环状RNA对应的基因缺少内含子。

        在N2a细胞中进行RNA干扰或构建诱导表达各种FUS突变型，分析FUS基因功能与环状RNA的形成关系，结果表明FUS基因丧失或不能正确定位于细胞核内都会明显降低环状RNA的形成效率，这其中也包括ALS疾病相关的FUSR521C和FUSP525L突变型。

        对于FUS干扰后表达降低的环状RNA，两种突变型均不能有有效的恢复其表达状态，野生型FUS则可以。而对于那些FUS干扰后会升高的环状RNA，两种突变型与野生型均能降低其表达。两种突变型会导致不能有效定位至细胞核中，这些结果说明FUS突变后与U1-70K的相互作用减弱，会影响一部分环状RNA的生成效率。而即使非常少量的FUS蛋白进入细胞核（两种突变型可以少量地位到核内），通过结合SMN也可以有效抑制一些环状RNA相关的RNA剪接作用过程。作者也在人的ES细胞中验证了这些实验。

图4 N2a细胞中各种FUS突变和干扰条件下环状RNA 的表达情况（来自[1]）

FUS结合环化位点的外显子/内含子交界处

        作者通过重新分析已发表的小鼠大脑FUS蛋白CLIP-Seq的数据，分析所筛选到的134种环状RNA的环化位点周围结合情况，分析环化位点500nt的范围。结果表明FUS敲除后有明显变化的环状RNA所对应的环化位点两侧的内含子中FUS结合的情况明显高于不变化的环状RNA。

图5 FUS倾向于结合环化位点两侧的序列（来自[1]）

        作者分别构建了受FUS敲除后上调和下调的环状RNA的人工表达载体，模拟內源的环状RNA形成过程，看FUS干扰前后对环状RNA形成的影响情况，结果与预期一致，说明FUS确实是调控环状RNA的形成过程的。

图6 设计载体验证FUS促进环状RNA形成（来自[1]）

        这篇文章的发现比较有意义，首先丰富了我们对神经系统环状RNA形成机制的认识。神经系统是人体内环状RNA最丰富的组织，这其中的环状RNA是如何形成的还没有完全研究清楚，本文的发现丰富了对该问题的认识。其次，本文首次报道了FUS基因疾病相关的突变与环状RNA形成过程的关系，对于探索疾病相关特异性变化的环状RNA形成机制提供了非常好的借鉴。

参考文献：

1. Errichelli, L., et al., FUS affects circular RNA expression in murine embryonic stem cell-derived motor neurons. Nat Commun, 2017. 8: p. 14741.

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