Nature文章揭示DHX9与环状RNA形成的关系

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声 明

        3月29日，Nature杂志在线发表了马普学会免疫生物学和表观遗传学研究所Asifa Akhtar教授的Letter文章，介绍发现RNA解旋酶DHX9可特异性结合反向Alu元件，参与调节环状RNA的形成[1]。

该文章的想法怎么来的？

        哺乳动物中存在一种针对双链RNA的效应通路，称为dsRNA response。目前已知的这一效应机制的相关基因包括ADAR、PKR、Staufen、MDA-5 和 RIG-I。DHX9的基因结构与ADAR和 PKR非常相似，并且DHX9在细胞在内的含量非常丰富，然而关于DHX9在细胞内的作用研究还非常少。因此，作者开展本项研究的切入点正是要揭示DHX9基因的功能。

图1 DHX9基因结构与ADAR和 PKR非常相似（来自[1]）

文章的主要逻辑思路和结论

        DHX9与ADAR和PKR基因如此相似，首先需要分析与DHX9相互作用的RNA序列，找出共性特征。作者分别用uvCLAP和FLASH进行了分析，表明DHX9与Alu元件有较强的相互作用。由于Alu元件是灵长类特有的，作者用小鼠模型分析到小鼠中DHX9主要与B1元件相互作用。这些SINE元件往往形成特殊的RNA结构，DHX9可以捕获的Alu元件间距明显低于未被捕获的Alu元件间距，说明DHX9实际上是通过结合由反向SINE元件形成的特殊双链RNA结构发挥功能的。反向互补RNA序列是形成环状RNA的重要原因，作者在敲除DHX9后环状RNA形成的种类和数量都有非常明显的增加。有些基因的3’-UTR也带有反向互补Alu元件，作者通过构建报告基因系统证明了DHX9也参与调节这类基因的功能。很多基因的转录后RNA剪接过程会受到Alu元件的调控，作者在DHX9敲除细胞的测序结果中发现了非常多的基因的RNA剪接过程受到了影响，作者也选取了有代表性的CCL25基因进行了验证。DHX9基因敲除后还会导致细胞出现奇怪的包含多个小的多形性核的巨细胞结构，通过成像学和相关基因的分析，证明是由于DHX9基因敲除后影响了SPC24基因的功能导致的。最后作者还基于SILIC分析了与DHX9相互作用的蛋白，找到了80多个，通过RNase消化对照，绝大部分是借助RNA的桥接作用在SILIC实验中被钓取到的，有趣的是ADAR的一种剪切变体ADAR(p150) 是不依赖RNA桥接作用的与DHX9相互作用蛋白。最终通过这一系列的深入分析，作者得出结论，DHX9通过与ADAR(p150)相互作用，协同调节RNA转录后加工过程，通过识别以反向Alu序列为代表的反向互补元件形成的RNA双链结构，促进其解螺旋，减少形成环状RNA的倾向，精密的调节基因转录后剪接作用。

        下面我们分别详细介绍本文思路的各个主要部分是如何一步步进行的：

紫外交联法获得DHX9相互作用RNA序列信息

        作者采用了紫外交联亲和纯化（uvCLAP）鉴定与DHX9相互作用的RNA，然后分析这些互作序列的共性。

图2 两种紫外交联技术分析DHX9相互作用RNA序列（来自[1]）

        作者发现DHX9互作序列集中在内含子区，大部分富集在Alu元件序列上。

图3 DHX9互作序列富集在Alu元件上（来自[1]）

        作者也用另一种紫外交联技术（FLASH）验证了这一结论。两种方法相互比较并借助多种分析策略，最终作者得出了DHX9可特异性结合Alu元件的结论。

图4 两种紫外交联分析技术一致表明DHX9倾向于结合Alu元件（来自[1]）

        Alu元件为灵长类特有的，在其他物种中DHX9结合什么序列呢？作者构建了内源DHX9插入3×Flag标签的细胞，利用uvCLAP分析，表明小鼠中DHX9倾向于结合B1序列元件。

图5 小鼠中DHX9倾向于结合B1元件 （来自[1]）

        DHX9为RNA结合蛋白，Alu元件和B1元件以及果蝇中的roX元件都会倾向于形成特殊的双链RNA结构，从而激发DHX9的功能。在紫外交联的实验中，并非所有的Alu元件都会被DHX9结合，会不会是Alu元件的分布也会影响DHX9的结合？ 于是作者利用工具软件（YASS）分析了DHX9结合与不结合的Alu元件的分布状态，结果表明不被DHX9结合的Alu元件间中位间距达1482nt，而DHX9结合的Alu元件间的中位间距为458nt，差别非常明显，因此作者认为DHX9结合的是适当间距的Alu元件行车了合适的双链RNA结构。

图6 DHX9结合的Alu元件间距分析（来自[1]）

DHX9调节环状RNA的形成

        以Alu元件为代表的反向互补RNA序列是环状RNA形成的重要因素。上面的结果表明DHX9是通过结合合适间距的反向Alu元件发挥功能的，那么很自然的产生一个问题：DHX9是否调控环状RNA的形成？DHX9基因RNA干扰的结果表明，DHX9基因敲降后细胞内环状RNA的种类有非常高的增加，从对照的25658种敲降后猛增至50355种！在DHX9基因敲除的细胞中，可形成环状RNA的基因产生的环状RNA甚至增加了四倍！

图7 DHX9敲降后大大提高环状RNA形成的种类数（来自[1]）

        作者也选取了一些有代表性的环状RNA进行了QPCR验证。

图8 DHX9基因敲降后提高环状RNA形成数量（来自[1]）

DHX9调控带反向Alu调控元件的mRNA的功能

        有些mRNA的3’-UTR也带有反向互补Alu元件，作者也分析了DHX9对这些基因的影响，结果表明敲除DHX9能明显降低携带3’-UTR反向互补Alu元件是报告基因的活性。

图9 荧光素酶报告基因分析DHX9对3’-UTR的反向Alu元件的调控作用（来自[1]）

        在DHX9基因敲除的细胞中回补野生型DHX9能恢复其功能，而回补解旋酶功能缺失突变体则不能恢复，这说明DHX9是通过解开反向互补的Alu序列，而不是仅仅结合在上面发挥作用。

图10 DHX9解螺旋酶功能缺失性突变不能恢复DHX9敲除的影响（来自[1]）

DHX9调控RNA剪接作用

        反向Alu元件有助于环状RNA的形成，也会影响对应的线性RNA的剪接加工过程，表现为掩盖一些RNA剪接信号或终止信号。DHX9会不会对RNA剪接的过程由影响？作者分析了DHX9敲除细胞中Poly(A)+的RNA-seq情况，结果表明DHX9敲除后，转录后剪接过程受到影响的基因非常多，多达5890个基因，对应于9146个外显子。

图11 DHX9基因敲除后mRNA的剪接过程受到非常大的影响（来自[1]）

        作者挑选了变化最明显的CCL25基因进行了验证，表明DHX9敲除后CCL25会明显上调。对该基因的结构分析表明，DHX9基因敲除后导致的转录后剪接/终止信号失效。

图12 DHX9基因敲除对CCL25转录后RNA剪接作用的影响（来自[1]）

DHX9敲除对细胞形态的影响和机制

        作者通过显微镜观察，发现DHX9基因敲除后细胞呈现特殊的含有多个小的多形性核的巨细胞状态。

图13 DHX9基因敲除后细胞形态的变化（来自[1]）

        这与先前报道的细胞“葡萄表型”很类似，从文献报道的细胞“葡萄表型”相关的153种基因中，作者发现在DHX9基因敲除后SPC24下最为明显，且该基因的3’-UTR含有反向Alu元件。于是作者就深入分析了DHX9基因敲除对SPC24的影响机制和与细胞表型的关系。证明DHX9基因敲除后的确降低了SPC24基因的正确转录产物的生成，导致了所观察到的细胞形态变化现象。

图14 DHX9基因敲除后显著降低SPC24基因的正确剪接产物生成（[1]）

DHX9体内互作蛋白筛选鉴定

        DHX9在体内相互作用的蛋白会有哪些呢？作者采用了SILIC实验进行筛选，共找到80个有较明显相互作用信号的蛋白，绝大部分为RNA相互作用蛋白，进一步，基于RNase消化对照，证明这些筛选到的互作蛋白大部分是基于RNA桥接实现的。其中ADAR(p150)是直接与DHX9相互作用的。

图15 DHX9与ADAR(p150)相互作用（来自[1]）

结论：

        经过系统的研究论证，作者得出结论：以Alu（灵长类）或B1（小鼠）为代表的SINE元件对基因表达有重要影响，反向互补的SINE元件形成特殊的双链RNA结构，影响线性RNA的剪接和环状RNA的形成。DHX9通过与ADAR(p150)相互作用，促进这种双链RNA结构的解螺旋，微调控基因转录产物的剪接作用和转录后产物的功能。DHX9基因敲除后会大大提高环状RNA形成的数目和种类。

图16 DHX9调控RNA剪接和功能 （来自[1]）

        本文的工作非常细致全面，实验设计也非常严谨。本文首次系统研究了DHX9在Alu元调控基因转录后加工和功能调控中的重要作用，提高了对人类基因组中转座元件的功能认识，也增进了对反向Alu元件调控线性和环状RNA形成机制的认识。

        本文的结论可以启发我们如何研究感兴趣的基因的线性和环状RNA产物间相互关系的问题。反向互补序列是环状RNA形成的重要基础条件，但同一基因在不同生理或病理条件下产生环状RNA的效率经常会有较明显的差别，说明一定存在尚未报道的精密的调控机制，DHX9是不是这一机制的一部分，也未可知。或许可以从DHX9相互作用的蛋白入手找到可能的通路和机制。

        环状RNA和成熟的mRNA可视为统一基因转录产物的不同加工终产物，它们之间会不会有相互作用？两者的形成过程有没有联系？已有少量的文献报道成熟的环状RNA与对应的mRNA存在相互作用，但这方面的研究只能算是刚刚起步，人类基因对应的环状RNA高达十几万种，并且还可能会有更多。这么多种类的环状RNA背后一定隐藏着很多非常有趣的机制。有待各位同仁们一起努力去揭开它们的神秘面纱。

参考文献：

1. Aktas, T., et al., DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature, 2017.

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