Theranostics杂志报道circRNA参与心肌修复调控

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声 明

        8月29日，Theranostics杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授为通讯作者的文章，介绍发现circ-Amotl1可通过结合PDK1和Akt1促进Akt1的磷酸化和入核，抑制细胞凋亡，促进心肌修复[1]。

        本文通过芯片法分析了新生儿与成年心肌组织中circRNA的表达差异，挑选已报道的与心血管系统有关的基因所对应的差异明显的circRNA分子，由此锁定了circ-Amotl1分子。它来源于Amotl1基因（Angiomotin-like 1）的第三外显子，为单一外显子形成的circRNA分子。但进化分析的情况来看，circ-Amotl1所对应的外显子及上下游内含子序列保守性并不高，人类基因组中circ-Amotl1所对应的反向拼接位点（junction point）在小鼠和大鼠中明显不同。对于这种保守性不高的circRNA分子，其功能会怎样呢？该如何研究其功能呢？小鼠模型该怎么解决？

        本文作者首先分析了circ-Amotl1在细胞模型中的基本功能，然后利用表达载体在小鼠模型中过表达circ-Amotl1观察表型，最后再进行分子机制的分析研究。

circ-Amotl1在细胞模型中的作用

        基于芯片法分析新生儿与成年个体心脏组织circRNA表达差异，结合所对应基因的功能，来源于Amotl1基因的第三外显子的circ-Amotl1最符合条件。QPCR分析表明随着年龄的增高，circ-Amotl1的表达呈现逐渐下降趋势。作者也进行了Northern实验进一步验证该分子的存在。构建了过表达载体在MCF7和YPEN等细胞中进行了相关鉴定。

图1 circ-Amotl1表达分析（来自[1]）

        在多种细胞中过表达circ-Amotl1，表明该circRNA可促进细胞增殖，抑制凋亡。针对circ-Amotl1进行RNAi后则抑制增殖并促进凋亡。

图2 circ-Amotl1影响细胞增殖和凋亡 （来自[1]）

circ-Amotl1在小鼠模型中的作用

        多柔比星（Dox）诱导心肌病模型小鼠中，腹腔注射纳米颗粒包裹的过表达circ-Amotl1载体能显著缓解相关症状。

图3 过表达circ-Amotl1可保护小鼠心肌 （来自[1]）

        过表达circ-Amotl1也能显著减少细胞凋亡。

图4 过表达circ-Amotl1可减少凋亡 （来自[1]）

circ-Amotl1对Akt的影响

        分子机制方面，作者实验中发现pAkt会伴随着过表达circ-Amotl1而升高。细胞定位分析中发现circ-Amotl1更倾向于分布于细胞核中。免疫组化实验也证明过表达circ-Amotl1后pAkt增加，且更多分布于核内。这些实验结果说明pAkt与circ-Amotl1的作用途径有关，在培养细胞中添加Akt抑制剂Triciribine后发现，随着其浓度增高会逐渐削弱过表达circ-Amotl1对细胞增殖的影响。

图5 circ-Amotl1对Akt的影响 （来自[1]）

如何证明circ-Amotl1可以结合PDK1和Akt？

        基于AGO2的RIP实验，作者发现该方法可以检测到circ-Foxo3，却不能检测到circ-Amotl1。利用特异性靶向circ-Foxo3或circ-Amotl1的探针进行RNA Pull-down实验，两种探针均能有效捕获靶分子，但只有circ-Foxo3能捕获到AGO2蛋白，circ-Amotl1不能。因此circ-Amotl1可能并非通过竞争性结合miRNA分子发挥功能的。通过分子模拟，作者发现circ-Amotl1可以结合Akt1和PDK1。干扰circ-Amotl1后，抗Akt1和PDK1抗体捕获的circ-Amotl1明显减少，pAkt1入核的比例也明显降低。靶向circ-Amotl1的探针捕获的Akt1和PDK1量也明显下降。说明circ-Amotl1、Akt和PDK1存在相互作用关系。

图6 （来自[1]）

        为进一步证明三种分子的相互作用关系，作者利用封闭核酸分子进行了验证。该封闭分子并不影响circ-Amotl1、Akt和PDK1的表达量。RIP和RNA Pull-down实验均证明，表达了该封闭分子后明显抑制了circ-Amotl1与Akt和PDK1的相互作用，也会影响Akt1的磷酸化和入核，对细胞增殖和凋亡的作用也被削弱。

图7 封闭分子阻断circ-Amotl1的作用途径（来自[1]）

        本文的故事不算复杂，但对于circRNA研究的参考价值还是非常高的。首先，本文提供了非保守性circRNA分子功能研究的范例。circ-Amotl1并不是高度保守的circRNA分子，但从实验结果来看其功能是非常明显的。因此，在针对特定circRNA进行研究的时候，进化保守性并不是决定性的因素，有明显功能的circRNA都值得深入探索。其次，本文提供了非miRNA Sponge功能研究的思路。作者通过正向的抗AGO2抗体进行RIP实验，及反向的基于靶向circ-Amotl1的探针进行RNA Pull-down，均有力证明了circ-Amotl1并不通过竞争性结合miRNA分子发挥作用。这一实验体系和思路对于求证特定是否竞争性结合miRNA具有非常高的参考价值，建议打算研究miRNA sponge功能模型的同行都考虑一下。这一研究思路和体系也充分说明RIP实验和RNA Pull-down技术对于circRNA研究的重要性。

参考文献：

1. Yan Zeng, W.W.D., Yingya Wu, Zhenguo Yang, Faryal Mehwish Awan, Xiangmin Li, Weining Yang, Chao Zhang, Qi Yang, Albert Yee, Yu Chen, Fenghua Yang, Huan Sun, Ren Huang, Albert J Yee, Ren-Ke Li, Zhongkai Wu, Peter H Backx, Burton B Yang, A Circular RNA Binds To and Activates AKT Phosphorylation and Nuclear Localization Reducing Apoptosis and Enhancing Cardiac Repair. Theranostics, 2017.

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