重大发现：circRNA存在细胞特异性m6A修饰！

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声 明

        8月29日，Cell子刊Cell Reports在线发表了哈佛大学医学院Cosmas C. Giallourakis和Alan C. Mullen为共同通讯作者的文章，介绍发现circRNA广泛存在m6A修饰，且呈现细胞特异性的特征[1]。

        m6A是RNA最常见的共价修饰方式之一，之前在线性的mRNA和lncRNA中均有报道，circRNA中是否也有m6A修饰是一个非常值得探索的重要科学问题。就在今年3月10日Cell Research杂志发表的中科院上海计算生物学研究所王泽峰教授为通讯作者的文章曾介绍发现circRNA中存在m6A修饰并可促进circRNA翻译蛋白[2]。这也是首次报道circRNA中存在m6A修饰。

        本文进一步证实了circRNA中存在m6A修饰，还发现了一些m6A修饰的circRNA 的特征，包括：

（1） m6A修饰的circRNA所对应的线性RNA中同一位置很少被m6A修饰，mRNA更倾向于在其3’UTR区携带m6A修饰。

（2） m6A修饰的circRNA呈现高度的细胞特异性分布，相同的circRNA分子在不同的细胞中m6A修饰的状态也不尽相同。

（3） m6A修饰的circRNA往往对应于较大的外显子区域，且两侧倾向于存在转座元件。

（4）circRNA与线性RNA有共同的修饰酶和识别酶。METTL3参与circRNA的m6A修饰， YTHDF1/YTHDF2参与识别。

（5） m6A修饰的circRNA所对应的mRNA相对更不稳定。

        大家一定已经迫不及待的想要知道作者是如何发现circRNA的m6A修饰并找出这些特征来的，下面我们就一起学习一下吧： 

作者利用什么技术探索circRNA 的m6A修饰的？ 

        RNA中m6A修饰主要通过特异性的抗体进行研究，本文的技术方法也是如此。作者首先利用斑点杂交实验证明了去除核糖体RNA后经过RNase R消化后的RNA样品中存在m6A修饰。抗m6A抗体进行RIP实验中未能与抗体结合的RNA组分（sup）杂交结果为阴性，而可以结合该抗体的RNA组分（eluate）杂交结果为阳性，证明了所使用的抗m6A抗体可以特异性识别m6A修饰，且不会引入假阴性结果，即所有携带m6A修饰的RNA可以全部被检测到。

        值得一提的是，tRNA往往不容易被RNase R消化，但已有的文献报道表明tRNA很少携带m6A修饰。抗m6A抗体RIP中Eluate部分缺少75nt组分也间接证明了这一点。

图1 斑点杂交实验证明circRNA中存在m6A修饰 （来自[1]，排列有改动）

        作者还专门设计了一套分析circRNA的流程体系，称为AutoCirc。从文中描述的结果来看，AutoCirc体系运行速度更快，比CIRCexplorer快10倍，比MapSplice快250倍，且对计算的硬件要求不高。

        作者在本文主要用该流程体系分别分析抗m6A抗体RIP实验后获得的RNA样品和常规RNA样品中的差异情况，通过分析所对应的基因组区域及不同来源样品间的横向比较得出了circRNA中m6A修饰特征。

        为证明抗m6A抗体RIP实验的特异性，作者还进行了内标实验，即在所分析的RNA样品中加入确定携带或不携带m6A修饰的内标，看最终分析获得数据中是否会存在假性的结果。结果表明该流程体系结合去除rRNA后抗m6A抗体RIP实验能非常特异性的富集m6A修饰的内标，说明了该体系的特异性和有效性，可有效避免假阳性，假阴性的情形。

图2 AutoCirc流程分析circRNA（来自[1]）

circRNA中m6A修饰有何特征？ 

        作者首先选择了人胚胎干细胞（hESCs）进行分析，利用该流程体系，分析了m6A修饰RNA与总RNA的情况，分别比较分析了其中circRNA和所对应的线性RNA的情况。

m6A修饰circRNA总体情况

        作者在hESCs样品中共分析到1404种m6A修饰circRNA，它们有41%可以从总circRNA分析的结果中找到（比例有点低，原因不明），但如果将ENCODE数据库的non-polyA RNA数据整合之后，就有83%的可以在hESCs来源的circRNA库中找到。

        m6A修饰circRNA与总circRNA的基因来源大致一致，主要是mRNA的外显子来源，也有一定比例的内含子来源。

图3 hESCs中m6A修饰circRNA总体情况 （来自[1]，排列有改动）

m6A修饰circRNA对应于更大的单个外显子

        与总circRNA的特征相类似，绝大部分m6A修饰circRNA也是外显子来源的。作者首先分析了m6A修饰circRNA所对应的外显子的情况，包括外显子数目，大小特征等。比较之后发现m6A修饰circRNA所对应的外显子相对更大。所对应的外显子数目来看，m6A修饰circRNA所对应的外显子数目以1-2个为主，随着外显子数目增多而逐渐减少。因此m6A修饰circRNA倾向于对应于更大的单个外显子。

图4 m6A修饰circRNA对应外显子特征分析 （来自[1]）

circRNA与所对应的mRNA携带的m6A修饰位点分布不同

        mRNA中m6A修饰倾向于集中在最后一个外显子，对应于成熟mRNA的3’UTR区，而circRNA很少有来源于该区域的，那么circRNA与所对应的mRNA携带的m6A修饰位点分布情况如何呢？

        绝大部分m6A修饰的circRNA均可从总RNA中检测到所对应的mRNA，但circRNA和对应的mRNA所携带的m6A修饰位点分布差别非常明显。circRNA来源的m6A修饰位点倾向于对应上游和中间的外显子区域，而mRNA来源的m6A修饰位点倾向于对应于末端3’UTR区。

图5 circRNA与对应mRNA的m6A修饰位点分布不同 （来自[1]）

circRNA的m6A修饰呈现细胞特异性特征

        circRNA的m6A修饰在不同来源的样品中是否一样呢？为回答该问题，作者利用Hela细胞进行了比较。总体而言，m6A修饰的circRNA在两种细胞中差别非常大，hESCs和Hela细胞遗传背景和基因表达特征有较大的差别，circRNA表达谱有差异也很正常。那么排除细胞特异性的总circRNA表达谱差异的因素，同一mRNA来源的circRNA的m6A修饰状态以及同一circRNA在不同细胞之间的m6A修饰状态有无差别？

        作者挑选了在hESCs和Hela中均有表达的mRNA基因进行分析，比较后发现这些基因所对应的m6A修饰circRNA有较大的差异，高达65%的来源于Hela的m6A修饰circRNA无法在hESCs中检测到。说明即使mRNA都有表达，所对应的m6A修饰circRNA还是会有明显的细胞特异性特征。

        反过来，相同的circRNA在不同细胞内m6A修饰的状态怎样？比较分析Hela和hESCs均有表达的circRNA分子，它们对应的m6A修饰状态也有较大差别。Hela来源的m6A修饰circRNA有41%的不会在hESCs中被修饰。

        值得一提的是，有些m6A修饰的circRNA所对应的mRNA并不能被检测到，这也可以部分解释上面的这两个分析角度所得到的差异状态有所区别。

图6 细胞特异性m6A修饰circRNA表达特征（来自[1]）

        上面的实验设计思路有点绕，可能不太好理解，而RT-PCR的实验就可以非常清晰的展示m6A修饰的circRNA细胞特异性表达特征。对于同一基因对应的circRNA在不同细胞中是否有表达会存在三种不同的情况：

（1）mRNA 在Hela和hESCs中均有表达，但circRNA只在Hela细胞中存在的： RASSF8 和KANK1的circRNA只在Hela中出现，并且可以被m6A修饰。

（2）mRNA 在Hela和hESCs中均有表达，但circRNA只在hESCs细胞中存在的： SEC11A和TMEFF1的circRNA只在hESCS中出现，并且可以被m6A修饰。

（3）mRNA 在Hela和hESCs中均有表达，并且circRNA也在Hela和hESCs中都存在的：

KIF20B 和 NUFIP2的circRNA在Hela和hESCs中均存在，也都可以被m6A修饰。

RAPGEF1 和ATP5C1 circRNA在Hela和hESCs中均存在，但RAPGEF1的circRNA只在Hela中被m6A修饰，ATP5C1的circRNA只在hESCs中被m6A修饰。

        因此，造成细胞类型特异性的m6A修饰的circRNA谱的差异因素不仅是细胞特异性的circRNA表达差异导致的，也存在细胞特异性的circRNA m6A修饰状态差异。

图7 RT-PCR分析细胞特异性circRNA m6A修饰状态 （来自[1]）

circRNA的m6A修饰程度有什么特征？

        特定的RNA分子被m6A修饰的比例会呈现不同的状态，mRNA的相关研究中就表明绝大部分的mRNA分子被m6A修饰的比例不会高于50%。circRNA中m6A修饰的比例是怎样的情况呢？为有效的度量circRNA中m6A修饰的比例，作者设计了一个量化指标：

        通过分析eluate/(eluate + supernatant)这一比值衡量特定circRNA被m6A修饰的比例，为实现eluate ，supernatant及total RNA数据间的可比性，需要用内标记的方法进行数据归一化（normalization）。

        总体而言，Hela中circRNA被m6A修饰的中位比例要高于hESCs，主要原因是Hela中存在一类能被高度m6A修饰的circRNA分子。而circRNA被m6A修饰的总量来看，hESCs略高一点。

        之前的研究报道表明m6A修饰往往促进mRNA的降解，那么在circRNA中m6A修饰与circRNA的丰度对应关系是怎样的呢？从数据分析的结果来看，Hela中m6A修饰与circRNA的表达量呈现正相关关系。hESCs中高m6A修饰的circRNA也与Hela中一样，而低m6A修饰的circRNA中却表现为负相关。因此作者认为在m6A修饰水平较低的时候，m6A修饰可能会导致circRNA的减少，而当m6A修饰程度达到0.3后，高水平的m6A修饰对应于高丰度的circRNA含量。

图8 circRNA被m6A修饰的程度分析（来自[1]）

circRNA中m6A修饰形成条件分析

        作者分析了m6A修饰的circRNA对应的基因组特征，发现存在m6A修饰的circRNA所对应的基因组区域两侧往往存在转座元件。

图9 m6A修饰的circRNA两侧存在转座元件（来自[1]）

        circRNA的m6A修饰酶方面，作者针对METTL3 和METTL14进行了RNA干扰实验。结果表明分别针对它们进行RNA干扰即可明显影响circRNA的m6A修饰状态，说明circRNA中介导m6A修饰的修饰酶与mRNA的情况类似，也是由METTL3 和METTL14介导的。

        circRNA的m6A修饰识别酶方面， RIP-Seq实验表明YTHDF1和 YTHDF2都是circRNA的m6A修饰识别酶。mRNA中AGO2也可以识别m6A修饰并导致RNA降解，但在circRNA中，AGO2结合的比例 相对较低。

图10 YTHDF1和 YTHDF2都是circRNA的m6A修饰识别酶（来自[1]）

m6A修饰的circRNA所对应的mRNA更不稳定

        在mRNA的相关研究中，YTHDF2结合m6A可调控进RNA的稳定性，那么在circRNA中情况是怎样的呢？比较分析后发现m6A修饰的circRNA所对应的mRNA稳定性要低于没有m6A修饰的circRNA所对应的mRNA。YTHDF2的结合与该过程有关。

图11 m6A修饰的circRNA所对应的mRNA更不稳定（来自[1]）

        本文大大提高了我们对circRNA中m6A修饰的认识，尤其是发现了circRNA存在细胞特异性的m6A修饰状态，暗示了circRNA中也存在表观转录组学的规律和机制，为进一步探索circRNA中m6A修饰提供了重要的线索。

        本文最大的贡献是发现了细胞特异性的circRNA m6A修饰状态，但机制解释不是非常清晰，并没有专门针对circRNA中m6A修饰的形成条件和机制展开探索。所选择的实验材料也不是非常合理。这也正好为进一步系统分析circRNA中m6A修饰的细胞特异性的分子机制，生理和病理意义等科学问题提供了机会。山人认为可以从以下几个方面进行进一步的探索：

（1）circRNA m6A修饰的分子机制：m6A的修饰酶，识别酶和去修饰酶是否一定与线性RNA完全一致？

（2）细胞特异性circRNA m6A修饰的形成机制，为什么会出现同一circRNA分子在不同细胞中m6A的修饰状态会有差别？这意味着什么？是否存在永远不会被m6A修饰的circRNA分子？

（3）是否存在疾病或生理活动特异性的circRNA m6A修饰行为？

（4）circRNA中存在circRNA特有的外显子，这类circRNA的m6A修饰是怎样的？这些circRNA特有的外显子与经典外显子的m6A修饰有没有差别？

参考文献：

1. Zhou, C., et al., Genome-Wide Maps of m6A circRNAs Identify Widespread and Cell-Type-Specific Methylation Patterns that Are Distinct from mRNAs. Cell Rep, 2017. 20(9): p. 2262-2276.

2. Yang, Y., et al., Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Res, 2017.

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