circRNA促进骨肉瘤细胞增殖、浸润和转移

        今天我们分享Oncotarget杂志在线发表的哈尔滨医科大学第一附属医院王文波主任为通讯作者的文章，介绍发现circRNA circ-0016347可促进骨肉瘤细胞增殖，浸润和转移[1]。

        该研究成果中circRNA（hsa-circ-0016347）过表达载体由吉赛生物提供。 

        circRNA作为内源竞争性RNA分子（ceRNA），竞争性结合miRNA分子是目前经常报道的功能模型之一。KCNH1基因在骨肉瘤细胞中高表达，并且促进骨肉瘤细胞的增殖和浸润。作者于是提出这样的一个假设思路：可否找出与KCNH1基因相关的起到ceRNA作用的circRNA分子？早期的研究曾发现miR-214是一种骨肉瘤的肿瘤促进因素，因此该miRNA也纳入了本文的探讨范围。骨肉瘤的发病过程经常伴随感染，半胱氨酸蛋白酶Caspase-1在感染相关的细胞因子IL- 1β 和IL-18的加工成熟中发挥关键作用，与骨肉瘤疾病有较强的相关性。

        作者首先基于信息学预测分析，预测与KCNH1基因相关的circRNAs，发现了本文的研究目标分子 hsa-circ-0016347。本文中作者主要探讨了circ-0016347/ miR-214/Caspase-1的相互关系及在骨肉瘤发病过程中的作用。

circ-0016347在骨肉瘤细胞中高表达

        在6组肿瘤组织和对应的癌旁组织中QPCR分析了circ-0016347的表达情况，结果表明肿瘤组织中存在明显的高表达。骨肉瘤细胞系中也佐证了这一现象。

图1 骨肉瘤中circ-0016347高表达 （来自[1]）

circ-0016347促进骨肉瘤细胞增殖和迁移

        紧接着，作者分析了circ-0016347对骨肉瘤细胞的增殖和迁移能力的影响情况。首先发现在RNA干扰实验中，癌细胞在干扰circ-0016347后增殖减慢，划痕实验表明干扰circ-0016347后细胞迁移能力下降，TransWell实验也证实了这一点。

        为探讨circ-0016347对肿瘤的作用情况，作者利用“吉赛生物”的circRNA过表达载体构建了过表达circ-0016347的载体，转染Saso-2细胞后经过尾静脉注射BALB/c小鼠，观察肿瘤体积和转移灶数目等指标。结果表明，过表达circ-0016347后肿瘤的体积和转移灶数量均明显高于对照组。这有力的说明了circ-0016347促进骨肉瘤细胞增殖和迁移能力。

图2 骨肉瘤中circ-0016347促进细胞增殖和转移（来自[1]）

Caspase-1的表达与circ-0016347相关

        由于Caspase-1与骨肉瘤相关的感染通路细胞因子的加工成熟有关，那么Caspase-1在骨肉瘤中的表达情况如何呢？与circ-0016347有没有相关性？于是作者在所选取的6例临床样本中分析了Caspase-1的表达情况，QPCR和Western实验均表明在骨肉瘤中Caspase-1有非常明显的高表达特征。在骨肉瘤细胞系中也表现出高表达的特征。为分析circ-0016347与Caspase-1的表达有没有相关性，作者通过RNA干扰实验进行了分析。结果表达干扰circ-0016347后，Caspase-1表达明显下调。因此，circ-0016347与Caspase-1的表达相关。

图3 Caspase-1的表达与circ-0016347相关（来自[1]）

Caspase-1是miR-214的下游调控分子

        本文作者希望找到circ-0016347影响Caspase-1表达的通路，结合已报道的miR-214在骨肉瘤中的作用，于是分别从miR-214对Caspase-1的影响及它与circ-0016347的关系两个方面进行了探索。首先利用TargetScan Human 5.1工具分析了miR-214在Caspase-1的全长mRNA中的结合位点情况，发现3'UTR包含了miR-214的结合位点。荧光素酶实验也证明了miR-214能影响Caspase-1的3'UTR区域。进一步的RNA干扰实验和突变实验证实了miR-214可调控Casapase-1的表达。

图4 Caspase-1是miR-214的下游调控分子

miR-214与circ-0016347的关系

        另一方面，还需要弄清楚miR-214与circ-0016347的关系。基于预测分析，作者找到了miR-214在KCNH1基因上的结合位点，作为来源于该基因的circRNA，circ-0016347具备了竞争性结合miR-214的理论条件。接着，作者在骨肉瘤细胞中将circ-0016347干扰后看miR-214的抑制分子（AMO-214）对miR-214，circRNA和Caspase-1表达的影响情况。结果表明干扰circ-0016347后，miR-214的表达明显升高，但AMO-214分子则能阻止该变化。干扰circ-0016347后，Caspase-1表达下降，AMO-214分子可阻止该变化，Western实验也证明了这一点。这说明circ-0016347通过miR-214调控了Caspase-1表达。

图5 miR-214与circ-0016347的关系（来自[1]）

        本文主要讲述了骨肉瘤中circ-0016347如何通过miR-214调控Caspase-1表达的情况，整体思路属于传统的ceRNA研究思路策略。文中利用过表达载体转染的细胞进行体内成瘤实验，分析了肿瘤体积和转移灶数目，为circ-0016347在骨肉瘤中的作用提供了很强的体内实验证据，为文章增色不少。本文的行文思路也为广大医学背景的研究者提供了较好的借鉴。

参考文献：

1. Jin, H., et al., Circular RNA hsa-circ-0016347 promotes proliferation, invasion and metastasis of osteosarcoma cells. Oncotarget, 2017. 8(15): p. 25571-25581.

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