circRNA MYLK作为内源竞争性RNA在膀胱癌在发挥重要作用

        7月4日，Cancer Letters杂志在线发表了重庆医科大学陈俊霞教授为通讯作者的研究论文，介绍发现circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2信号通路促进膀胱癌发生发展。

1. circRNA MYLK的筛选及验证

        文中作者利用微阵列芯片分析了4对人膀胱癌（BC）标本的癌及癌旁组织，发现circRNA MYLK与VEGFA在癌组织中共同高表达，且circRNA MYLK与VEGFA的4个转录的表达水平呈正相关，并证实了circRNA MYLK来自于3号染色体的MYLK基因。

图1 circRNA MYLK的筛选及其与VEGFA的关系

        然后在32例标本中通过FISH、RT-qPCR对circRNA MYLK进行了验证，通过免疫荧光对VEGFA的蛋白水平进行了验证，结果显示circRNA MYLK与VEGFA在膀胱癌组织中显著上调。

图2 circRNA MYLK与VEGFA在膀胱癌组织中上调

        从上面的结果得知circRNA MYLK在膀胱癌组织中显著高表达，那么它的表达水平是否与膀胱癌患者的预后有关呢？通过生存分析发现circRNA MYLK的表达水平与患者的预后呈负相关，更凸显了circRNA MYLK在膀胱癌中的重要意义。作者还发现与正常膀胱上皮细胞系相比，膀胱癌细胞系中circRNA MYLK也呈现高表达。这些线索强烈暗示了circRNA MYLK可能与膀胱癌的发生发展及预后有关。

 图3 circRNA MYLK与BC患者预后的关系及其在细胞系中的表达水平

2. circRNA MYLK在BC细胞系中的作用

        作者针对circRNA MYLK分别构建了过表达（ciR-MYLK）和干扰（sh-circ）载体，并用Northern blot和qRT-PCR进行了鉴定，表明只有ciR-MYLK能显著增加EJ和T24细胞中circRNA MYLK的表达，只有sh-circ能够显著性降低内源性的circRNA MYLK。

图4 载体的构建及验证

        接着探讨了circRNA MYLK对膀胱癌细胞增殖，凋亡，侵袭和迁移的影响，结果表明上调circRNA MYLK能够显著增强膀胱癌细胞的增殖、细胞活性、侵袭及迁移，而下调circRNA MYLK具有相反的效应。

图5 circRNA MYLK对EJ和T24细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

        作者还进一步构建了共培养体系，发现过表达circRNA MYLK的EJ细胞能够增强HUVECs的迁移及增殖能力，并且能够促进分支更多的管样结构的形成。以上结果能够有效地说明circRNA MYLK在BC细胞中具有促癌作用。

图6 transwell共培养体系

3. circRNA MYLK促进BC的生长与转移

        为了探索circRNA MYLK在体内的生物学功能，作者通过皮下接种稳转ciR-MYLK或mock的EJ细胞，构建了裸鼠BC移植瘤生长与转移模型，发现过表达circRNA MYLK显著增加了BC细胞系的致瘤性、肺转移及微血管形成，与对照组相比，促瘤率达186%。

图7 circRNA MYLK的过表达促进体内BC生长转移及微血管形成

        免疫荧光表明circRNA MYLK过表达组中，血管形成相关分子、VEGFA及间充质相关分子呈现高表达，而上皮相关标记物呈现低表达。免疫组化显示上调circRNA MYLK能够增加VEGFA及Rass/ERK1/2通路相关分子的表达。从这些结果可以看出circRNA MYLK可能通过VEGFA介导的血管生成，EMT及Rass/ERK1/2通路促进体内BC的生长与转移。

图8 circRNA MYLK调控下游相关分子的表达

4. circRNA MYLK直接结合miR-29a并抑制其活性

        为了弄清楚过表达circRNA MYLK促进BC增殖及转移的机制，作者首先通过miRBase进行了预测，circRNA MYLK能够与miR-29a结合。进一步通过Anti-AGO2 RIP实验发现转染miR-29a mimics的细胞中用抗Ago2抗体能够显著富集circRNA MYLK，表明circRNA MYLK可直接与miR-29a靶向结合。

图9 RIP实验发现circRNA MYLK与miR-29a存在相互作用

        利用FISH技术，发现circRNA MYLK与miR-29a在BC细胞和组织中存在共定位。双荧光素酶报告基因发现上调miR-29a能够显著降低野生型reporter的荧光素酶活性，也表明了circRNA MYLK通过互补种子序列与miR-29a相互作用。

图10 FISH及双荧光素酶报告基因实验

        同时，作者还发现在BC细胞系中过表达circRNA MYLK能够显著降低miR-29a的表达水平，而敲弱circRNA MYLK则具有相反的效应，但是miR-29a不影响circRNA MYLK的表达。这些结果表明circRNA MYLK可能作为miR-29a的“分子海绵”直接与其结合并抑制其活性。

图11 circRNA与miR-29a表达水平的关系

5. miR-29a靶向结合VEGFA并抑制BC细胞增殖与侵袭

        根据miRBase预测，VEGFA是miR-29a下游的靶分子，然后利用双荧光素酶报告基因实验进行了验证。

图12 双荧光素酶报告基因实验证明miR-29a与VEGFA存在相互作用

        作者进一步分析了BC细胞中miR-29a与VEGFA的表达水平，发现上调miR-29a能够显著降低VEGFA的mRNA及蛋白的表达，而下调miR-29a则出现相反的结果。还发现过表达miR-29a能够促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，侵袭及转移，并且共转miR-29a与VEGFA时，能够抵消miR-29a对细胞的抑制效应。这一系列结果表明miR-29a通过结合VEGFA调控其表达，进而对BC发挥作用。

图13 miR-29a调节VEGFA的表达影响BC细胞的增殖转移

6. circRNA MYLK通过竞争性结合miR-29a调控VEGFA的表达并导致EMT及Ras/ERK信号通路的活化

        为了探索circRNA MYLK促进BC生长及转移的分子机制，利用双荧光素酶报告基因发现过表达circRNA MYLK能够大大提高野生型VEGFA 3’ UTR reporter的荧光素酶活性，然而过表达miR-29a能够抵消这种效应。并且与单转ciR-MYLK相比，在BC细胞中共转ciR-MYLK与miR-29a能够减少VEGFA的表达。

图14 circRNA MYLK通过竞争性结合miR-29a调控VEGFA的表达

        在BC细胞系中利用一系列共转实验进一步证实了circRNA MYLK是作为miR-29a的“分子海绵”调控其靶基因VEGFA的表达，并导致EMT及Ras/ERK信号通路的激活。

图15 circRNA MYLK通过竞争性结合miR-29a调控VEGFA及下游相关分子的表达

7. VEGFA/VEGFR2和Ras/ERK信号通路的激活参与了circRNA MYLK介导的致瘤作用

        为了证明VEGFA/VEGFR2和Ras/ERK信号通路是circRNA MYLK致瘤的所必须的，作者首先在BC细胞中验证了过表达circRNA MYLK能够增加VEGFA的分泌，且能够促进VEGFR2的磷酸化。然后利用针对VEGFA的贝伐单抗和VEGFR2的特异性抑制剂Ki8751反转了过表达circRNA MYLK产生的一系列效应，包括对Ras/ERK信号通路相关分子的作用以及细胞的增殖，侵袭及转移等。这些数据证实了VEGFA/VEGFR2和Ras/ERK信号通路参与了circRNA MYLK的致瘤作用。

图16 circRNA MYLK激活VEGFA/VEGFR2及Ras/ERK信号通路

        至此，全文结束。文章通过严谨的实验有力地论证了circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2通路促进BC的发生发展，是一篇难得的miRNA sponge功能模型的文章。

参考文献

1 Zhong Z, Huang M, Lv M, He Y, Duan C, Zhang L, Chen J. Circular RNA MYLK as a competing endogenous RNA promotes bladder cancer progression through modulating VEGFA/VEGFR2 signaling pathway. Cancer Lett. 2017.

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