Molecular Cell：细胞识别内源/外源circRNA的机制

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声 明

        6月15日，Molecular Cell杂志在线发表了一项重要的circRNA研究成果，介绍发现了细胞识别内外源circRNA的机制[1]。文章的通讯作者是斯坦福大学医学院的Howard Y. Chang教授。

        文中作者尝试基于体外转录后自动拼接环化获得circRNA，以此转染细胞，意外的发现了体外获得的circRNA会诱导细胞自身免疫效应通路的激活，并抑制RNA病毒的感染过程，该过程由RIG-I介导，内源的circRNA由于结合一些RNA结合蛋白而不会诱导该通路[1]。

体外转录获得circRNA的体系

        I类内含子具有自我剪切成熟的特性，不需要借助剪切体等因子协助，因此基于I类内含子设计circRNA表达载体可以实现体外转录产物的自动环化，生成目标circRNA。作者选择T4噬菌体的胸苷合酶（td）基因内含子，构建了可自动环化的circRNA表达载体。

图1 基于T4噬菌体td基因I类内含子构建的circRNA表达载体（来自[1]）

        利用RNase R消化后，线性的RNA可被完全降解掉，而circRNA不会被降解。测序结果也证实了所获得的circRNA序列完全正确。体外转录后结合RNase R消化可获得高纯度的circRNA。

图2 体外转录结合RNase R消化可获得序列准确的circRNA（来自[1]）

体外获得的circRNA诱导细胞自身免疫信号通路活化

        体外获得的circRNA能否直接用于细胞转染？这是个非常有意义同时也非常有趣的问题。作者在实验中却发现，将基于上述体系获得的体外自动拼接并经过RNase R消化后的circRNA瞬转Hela细胞并未获得GFP信号，反而导致细胞大量死亡（相对于同样序列的线性RNA对照）。于是经过二代测序转录组分析，作者发现体外转录获得的circRNA诱导细胞自身免疫相关的信号通路激活。包括RIG-I，MDA5等基因。这一现象也在HaCaT细胞（人表皮细胞）和RAW264.7细胞（小鼠巨噬细胞）中得到证实。

图3 体外转录获得circRNA诱导细胞自身免疫反应通路激活（来自[1]）

体外获得的circRNA转染细胞后抑制RNA病毒的感染

        经过上述circRNA处理后的细胞自身免疫效应通路被激活，会不会抑制病毒感染的效率呢？于是作者在经过体外获得的circRNA处理后的细胞中进行RNA病毒感染实验，选择了携带GFP报告基因的委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV-GFP）。流式细胞仪分析结果显示在体外获得的circRNA处理细胞后，病毒感染效率明显降低，同样序列的线性RNA则不会有明显的影响。

图4 体外转录获得circRNA抑制RNA病毒感染（来自[1]）

RIG-I介导细胞识别体外源circRNA分子

        RIG-I和MDA5是细胞识别外源RNA分子的重要感受器分子，RIG-I报道主要识别带5’三磷酸基团的锅柄结构小RNA分子，MDA5识别长双链RNA分子。但外源circRNA分子由什么感受器分子识别还没有相关报道。于是作者在带IFNβ报告基因的293T细胞中分别表达RIG-I或MDA5，检测外源circRNA对报告基因的影响，结果表明RIG-I是识别外源circRNA的感受器分子。在敲除RIG-I的MEF细胞转染外源circRNA不会诱导相关基因的表达。Cas-9敲除RIG-I的Hela细胞现象也类似。Cy3标记外源circRNA后共定位分析表明外源circRNA与RIG-I存在共定位，相对于线性RNA对照，circRNA形成的斑点更大。

图5 RIG-I介导细胞识别外源circRNA分子（来自[1]）

细胞对外源circRNA的免疫效应无法用已知的免疫效应配体解释

        为进一步弄清楚外源circRNA诱导细胞免疫效应的机制，作者首先在外源circRNA中增加5’-磷酸酶处理，以彻底排除5’-三磷酸基团的干扰，结果表明处理后的外源circRNA依然能诱导细胞的免疫效应。说明与已报道的RIG-I识别带5’-三磷酸基团的小RNA诱导细胞免疫效应的机制有所差别。

图6 5’-磷酸酶处理不影响外源circRNA的效应（来自[1]）

        circRNA有别于线性的RNA分子，会不会存在二级结构的影响？作者利用2'-羟基酰化分析（SHAPE）进行了比较，该实验能识别游离的单链RNA碱基，通过测序比对，可有效反映RNA分子中游离状态的碱基。基于SHAPE分析和测序比对，作者未能在体外获得的circRNA分子中找到明显的特殊二级结构信息。说明体外获得的circRNA分子并没有明显特殊的二级结构。

图7 SHAPE实验比较线性和circRNA（来自[1]）

        会不会作者所选择的体外获得circRNA的体系中存在其他未知的产物干扰了实验结果？作者用了两个不同的实验体系进行了验证分析：一个是将基于自我剪切的内含子改为直接体外夹板连接（in vitro splint ligation）获得自连的circRNA。另一个是通过添加互补的DNA片段，经过RNase H处理，将circRNA切开变成线性的RNA。第一个实验所得到的circRNA依然会诱导细胞同样的效应，第二个实验中相应的细胞效应则完全消失。基于这两个实验，能有效排除未知状态的核酸分子对实验的可能干扰。

图8 不同实验排除其他类型分子对结果干扰的可能（来自[1]）

circRNA形成有关的内含子决定了细胞的效应方式

        会不会是作者选择的外源circRNA序列导致了相关的效应？于是作者改用mCherry验证，同时去掉IRES元件序列，结果依然表明会诱导细胞的免疫效应，说明不是序列特异性所导致的。排除了序列特异性的因素，作者继续用GFP的序列构建相关的载体在Hela细胞中进行转染实验。利用T4噬菌体td基因内含子生成circRNA组能明显诱导细胞免疫效应，但当换成ZKSCAN1基因内含子（由反向Alu元件驱动环化），细胞的免疫效应消失。同时，去掉一侧的内含子序列，构建表达线性RNA分子的组中两种来源的内含子构建的载体均不诱导细胞的免疫效应。而如果将内含子换成果蝇来源的Iaccase2基因内含子，并不诱导细胞的免疫效应。而当将ZKSCAN1基因内含子与td内含子构建在一起时，依然会诱导细胞免疫反应。

图9 内含子类型决定了细胞对circRNA的免疫效应（来自[1]）

内源circRNA结合多种蛋白因子

        细胞如何标记识别内源和外源circRNA的？会不会有结合蛋白的差别？在Hela细胞中表达不同的载体后进行RNA结合蛋白的质谱分析（ChIRP-MS），结果表明由内源内含子驱动环化的circRNA结合蛋白明显区别于外源circRNA。这些RBP的存在抑制了内源性circRNA与RIG-I的结合。

图10 细胞通过不同的RBP结合方式标记内源/外源circRNA（来自[1]）

        本文的故事非常有趣，提示外源获得的circRNA存在诱导细胞免疫效应的作用。或许这一机制可以用来作为抗RNA病毒的疫苗研发策略。这也提示我们今后要开发基于circRNA的药物或治疗策略时需要考虑机体的免疫效应或其他毒副作用。本文的结果还提醒我们，细胞内形成的circRNA很可能并非游离存在的，而是结合了包括蛋白在内的其他分子，这也为今后研究circRNA的功能提供了暗示信息。

参考文献：

1. Chen, Y.G., et al., Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol Cell, 2017.

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