深度长文--2017年度circRNA研究进展汇总（2）

声  明

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本篇目录

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circRNA与疾病相关性研究进展

2.1 circRNA与肿瘤

2.2 circRNA与心血管疾病

2.3 circRNA与其他人类疾病

2. circRNA与疾病相关性研究进展

circRNA与疾病的相关性一直是研究的重点领域，以肿瘤学为代表，2017年循环系统相关的研究也表现出迅速增长的态势。疾病相关性的研究大致思路相似，主要是首先基于高通量分析（二代测序或芯片法分析），找出疾病相关的特异性circRNA分子，然后预测分析其可能相互作用的miRNA分子和网络，进行通路分析。严谨的实验会基于各种验证实验对所提出的模型进行相关验证分析。

2.1 circRNA与肿瘤 

肿瘤学依然是circRNA研究的主要阵地，在传统的思路基础上，2017年的肿瘤学相关报道也发生了一定的变化，主要体现为特定circRNA的研究报道明显增多，竞争性结合miRNA分子不仅仅局限在生物信息学预测，还增加了实验验证。由于肿瘤学是个非常庞大的领域，按照不同种类的肿瘤，细分如下：

2.1.1 肝癌相关circRNA研究进展：

Hepatology杂志报道CircMTO1在肝细胞癌中的作用机制

5月18日，国际肝脏学杂志顶尖Hepatology杂志在线发表了曹雪涛院士的研究论文，介绍肝癌中环形RNA的研究工作，介绍发现了环形RNA CircMTO1通过竞争性结合miR-9抑制肝细胞癌增殖[21]。曹雪涛院士和第二军医大学于益芝教授为共同通讯作者。

首先，本文揭示的circMTO1在HCC中表达特征非常显著，且与肿瘤的预后相关性很强，具有非常重要的临床研究和应用价值。意义大价值高的东西更容易受到优秀杂志的青睐。其次，本文提出的分子机制证据充分，论证严谨。本文发现的circMTO1竞争性结合miR-9的分子机制模型经过了反复的论证，RIP实验和FISH实验非常有力的支持了circMTO1竞争性结合miR-9的结论，后续在细胞和动物模型的实验也很好的支持了circMTO1通过竞争性结合miR-9发挥对肿瘤的影响的假设 [21]。本文所展示的实验结果严谨而有力，不拖泥带水，简洁明了而又强有力的论证了所提出的机制模型，在已发表的miRNA Sponge功能模型的文章中也是比较难得的。清晰有力的逻辑论证也是本文的一大亮点，这也是高水平杂志能认可该工作的一个重要原因。

图21 circMTO1的肿瘤内沉默促进体内HCC的生长（来自[21]）

RNAZKSCAN1与circZKSCAN1以不同方式抑制肝细胞癌增殖和迁移

2月16日，Molecular Oncology杂志在线发表了中山大学附属第三医院刘波和杨扬为共同通讯作者的文章，介绍发现ZKSCAN1基因和它的circRNA产物circZKSCAN1以不同方式抑制肝细胞癌增殖和迁移[22]。

文中作者在102例肝细胞癌临床标本中分析了ZKSCAN1与circZKSCAN1的表达情况，发现癌组织中两种RNA分子均降低，两种分子过表达后均抑制肝细胞癌增殖和迁移，RNA-Seq结果表明两种分子的作用机制有所差别[22]。

图22 ZKSCAN1与circZKSCAN1以不同机制发挥作用（来自[22]）

其他肝癌相关circRNA研究报道

2.1.2 胃癌相关circRNA研究进展：

胃癌中circLARP4竞争性结合miR-424-5p调控LARP4的表达

9月11日，Molecular Cancer杂志在线发表了上海交通大学第六人民医院朱金水教授为通讯作者的文章，介绍发现胃癌中circLARP4通过竞争性结合miR-424-5p调控LARP4的表达[23]。

文章作者曾报道LATS1基因在Hippo通路中的作用，在胃癌中LATS1起到类似抑癌基因的作用。本文中作者首先分析了miR-424-5p与LATS1在胃癌中的表达关系以及与临床信息的对应关系，证明miR-424-5p与LATS1的表达量存在负相关。miR-424-5p表达越高，LATS1表达就越低，所对应的胃癌分级就越高，预后也越差。进一步的研究证明miR-424-5p可直接调控LATS1的表达。由于大量的文献报道表明circRNA可以通过竞争性抑制miRNA发挥作用，因此作者基于circRNA表达谱分析，circBase数据库检索及miRNA作用位点分析软件综合分析后筛选出了30种候选circRNA分子。由于胃癌中miR-424位高表达，因此作者挑选15种低表达的circRNA分子进行下一步分析，其中只有来源于LATS1基因第9,10外显子的circRNA（circLARP4）最符合要求。后续实验证明了circLARP4竞争性结合miR-424-5p，所用的实验技术包括双荧光素酶报告系统，RIP实验，FISH等。

图23 胃癌中circLARP4的作用机制（来自[23]）

其他胃癌相关circRNA研究报道

2.1.3 膀胱癌相关circRNA进展报道

circHIPK3在膀胱癌中竞争性抑制miR-558

8月9日，EMBO Reports杂志在线发表了华中科技大学同济医学院曾甫清教授和蒋国松教授为共同通讯作者的文章，介绍发现膀胱癌中circHIPK3通过竞争性结合miR-558抑制乙酰肝素酶表达[24]。

作者利用RNA-Seq分析了膀胱癌中circRNA差异表达的情况，共得到6154种差异表达的circRNAs，其中circHIPK3显著低表达。过表达实验表明circHIPK3可明显抑制膀胱癌细胞系的增殖和迁移。分子机制方面，作者利用了miRanda、PITA和RNAhybrid三种工具预测了可能相互作用的miRNA，比对分析后找出了12种完全重叠的miRNA分子。然后又通过RNA Pull-down实验证明了miR-558与circHIPK3有相互作用，荧光原位杂交实验进一步验证了这一相互作用[24]。

图24 circHIPK3竞争性结合miR-558（来自[24]）

circRNA MYLK作为内源竞争性RNA在膀胱癌在发挥重要作用

7月4日，Cancer Letters杂志在线发表了重庆医科大学陈俊霞教授为通讯作者的研究论文，介绍发现circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2信号通路促进膀胱癌发生发展[25]。文章通过严谨的实验有力地论证了circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2通路促进BC的发生发展，是一篇难得的miRNA sponge功能模型的文章。

作者利用微阵列芯片分析了4对人膀胱癌（BC）标本的癌及癌旁组织，发现circRNA MYLK与VEGFA在癌组织中共同高表达。然后通过扩大组织标本数量，与临床症状相关性分析等，表明circRNA MYLK可促进膀胱癌发生发展。然后基于预测和验证实验，最终阐明了circRNA MYLK作为ceRNA通过调节VEGFA/VEGFR2通路促进膀胱癌的发生发展[25]。

图25 circRNA MYLK的筛选及其与VEGFA的关系（来自[25] ）

CircRNA在膀胱癌早期诊断中的研究

11月28日，新开放的Nature子刊npj Genomic Medicine在线发表了丹麦奥胡斯大学Jakob Skou Pedersen教授和Trine Line Hauge Okholm教授为共同通讯作者的文章，介绍在膀胱癌中筛选circRNA的工作，Jørgen Kjems教授为共同作者[26]。

本文作者从早期的膀胱癌角度出发，考察circRNA是否可以作为膀胱癌潜在的临床诊断标记物，收集了457个NMIBC（(348Ta和109T1）非肌层浸润性膀胱癌标本进行全转录组高通量测序分析。鉴定出15223个circRNAs分子，设定阈值筛选出279个高表达的circRNAs分子进一步与临床特征进行关联分析，发现13个circRNAs与膀胱癌的进展存在相关性，可以作为潜在的诊断分子指标[26]。

图26 膀胱癌相关circRNA筛选鉴定 （来自[26]）

其他膀胱癌相关circRNA研究报道

2.1.4 结肠直肠癌相关circRNA进展报道

circRNA CCDC66促进结肠癌增殖和转移

3月1日，Cancer Research杂志在线发表了台湾国立成功大学Shaw-Jenq Tsai博士和H. Sunny Sun博士为共同通讯作者的文章，介绍发现circRNA CCDC66促进结肠癌增殖和转移[27]。

文章作者首先通过测序筛选结肠癌相关的circRNA，作者挑选了circCCDC66进行深入探索分析。发现circCCDC66能促进结肠癌细胞增殖和迁移。在结肠癌中circCCDC66过表达，并与结肠癌的临床症状表型有相关性[27]。

图27 circCCDC66促进结肠癌增殖和转移（来自[27]）

其他结肠直肠癌相关circRNA研究报道 

2.1.5 其他类型肿瘤相关circRNA进展报道

胶质瘤中circRNA circ-TTBK2作用机制

2月20日， Journal of Hematology & Oncology杂志在线发表了中国医科大学附属盛京医院刘云会教授为通讯作者的文章，介绍关于在胶质瘤中circRNA circ-TTBK2作用机制的研究[28]。

文章发现胶质瘤中circ-TTBK2上调而线性基因没有明显改变。过表达circ-TTBK2促进细胞增殖和迁移并抑制凋亡作用。与此同时，作者发现miR-217在胶质瘤中下降。进一步，作者发现circ-TTBK2可以作为miR-217的miRNA Sponge但线性的TTBK2没有这种作用。强制表达miR-217可抵消circ-TTBK2的作用[28]。

图28 胶质瘤中circRNA circ-TTBK2作用机制 （来自[28]） 

口腔癌中circRNA_100290竞争性结合miR-29家族发挥作用

4月3日，Nature子刊Oncogene在线发表了湘雅二院L Chen为通讯作者的文章，介绍发现circRNA circRNA_100290通过竞争性结合miR-29家族分子在口腔癌中的作用[29]。

在本中，作者通过芯片法分析了口腔癌和癌旁组织中circRNA的表达情况，发现了circRNA circRNA_100290与CDK6均在口腔癌中高表达。干扰circRNA_100290后CDK6表达也下降，且细胞增殖受到抑制。进一步通过荧光素酶报告系统，作者发现了circRNA_100290可以通过竞争性结合miR-29家族的分子发挥作用[29]。

图29 circRNA_100290通过竞争性结合miR-29家族分子在口腔癌中的作用（来自[29]）

环形RNA作为新型的乳腺癌诊断标志物

4月21日，Oncotarget杂志在线发表了南京医科大学王建明教授为通讯作者的文章，介绍一项在乳腺癌中开展的环形RNA差异表达分析，验证及疾病相关性分析的工作[30]。

本中作者共鉴定到1155种差异表达的环形RNA，其中715种上调。进一步鉴定后表明 hsa_circ_103110、 hsa_circ_104689 和hsa_circ_104821明显上调，而hsa_circ_006054、 hsa_circ_100219和 hsa_ circ_406697明显下调。最后在疾病相关性分析中发现联合 hsa_circ_006054、hsa_circ_100219 和 hsa_circ_406697后ROC曲线的AUC值能达到0.82，可作为有效的乳腺癌疾病诊断标志物[30]。

图30 三种环形RNA联合作为乳腺癌诊断标志物（来自[30]）

下咽鳞状细胞癌中差异表达环形RNA鉴定分析

4月27日，Oncotarget杂志在线发表了山东大学齐鲁医院耳鼻喉科潘新良主任和雷大鹏主任为共同通讯作者的文章，介绍一项在下咽鳞状细胞癌中环形RNA的研究工作[31]。

作者通过环形RNA芯片在4例下咽鳞状细胞癌（HSCC）和对应的癌旁组织中筛选分析差异表达的环形RNA，共得到2392种差异表达的环形RNA，其中1304种为上调。接下来作者又在32例标本中验证了所筛选到的差异最大的各10种环形RNA。作者也针对这些差异表达的环形RNA进行了竞争性结合miRNA预测和通路预测分析。

图31 下咽鳞状细胞癌中差异表达的环形RNA（来自[31]）

ANRIL在黑色素瘤中存在多种Isoform形式

6月27日，International Journal of Molecular Sciences杂志在线发表了新西兰奥克兰大学Graeme J. Finlay教授和Marjan E. Askarian-Amiri教授为共同通讯作者的文章。介绍发现在黑色素瘤中非编码RNA基因ANRIL存在多种Isoform形式，其中也包括circRNA[32]。

有报道表明非编码RNA 基因ANRIL的剪切方式存在组织特异性的特征，但有关该基因的剪切方式还缺少系统性的研究。本文作者选择两株黑色素瘤细胞进行分析，发现了ANRIL的剪切方式存在细胞类型特异性，也发现了该基因对应的circRNA。线性的ANRIL的主要定位于核内，而circ-ANRIL定位于胞质[32]。

图32 ANRIL功能通路（来自[32]）

白血病中MYC扩增区对circRNAs表达影响

11月28日，Leukemia杂志在线发表了意大利巴里奥尔多大学生物系Clelia Tiziana Storlazzi教授为通讯作者的文章，介绍在急性髓系白血病（AML）中Myc的基因组结构，进化和转录影响[33]。

急性髓性白血病AML基因组通常不稳定存在均质染色区（homogeneously staining regions，HSR）和双微体（double minutes，DMs）等基因扩增区域，本文研究者着重研究了白血病染色体8q24区域发现了MYC双微体扩增区，同时也发现环形RNA circPVT1的异常扩增，表明双微体扩增可引起circRNAs表达异常。作者收集了20例 AML基因组扩增样本，采用illumina的TruSeq捕获试剂盒捕获8q22.3-24.1区域进行RNA-seq检测，考察该区域基因表达情况[33]。

图33 CircPVT1在8q24区域同样异常高表达 （来自[33]）

其他类型肿瘤相关circRNA研究报道

2.2 circRNA与心血管疾病 

循环系统在2017年度circRNA研究报道出现爆发式增长，多篇高水平研究论文发表，从国家自然科学基金的受理情况来看，也是仅次于肿瘤学的重要领域方向。

circRNA参与平滑肌α-actin基因表达调控

7月11日，知名杂志Circulation Research在线发表了河北医科大学温进坤教授为通讯作者的文章，介绍发现血管平滑肌细胞中调控α-actin基因表达的通路，其中circRNA circACTA2发挥重要作用[34]。

血管平滑肌细胞（VSMC）在调节血压等方面发挥重要作用，α-actin（α-SMA）是最重要的细胞骨架成分。已知TGF-β1可影响α-SMA表达，但关于α-SMA在分子细胞水平表达调控机制还没有研究清楚。本文作者发现EGF家族成员NRG-1的可溶剪切变体形式NRG-1-ICD可影响α-SMA的表达。进一步的研究表明NRG-1-ICD通过结合到α-SMA的第一内含子上面，募集转录因子IKZF1，促进α-SMA基因来源的circRNA circACTA2的形成，circACTA2通过竞争性结合miR-548f-5p抑制后者对α-SMA的表达抑制作用。在本文的研究结果中表明circACTA2的形成似乎与QKI和ADAR2都有关系，但作者没有对此展开太详细的探讨[34]。

图34 血管平滑肌细胞中circACTA2竞争性结合miR-548f-5p（来自[34]）

circHIPK3在糖尿病视网膜血管障碍中的作用

8月31日，著名循环学杂志Circulation在线发表了复旦大学眼耳鼻喉科医院颜标教授与赵晨教授为共同通讯作者的文章，介绍发现circHIPK3在糖尿病视网膜血管障碍中的作用[35]。

本文报道发现在糖尿病引起的视网膜血管功能障碍中circHIPK3（hsa_circ_0000284）显著升高，进一步的研究表明circHIPK3可以竞争性结合miR-30a-3p、miR-30d-3p和miR-30e-3p，它们可以通过调控VEGFC、 FZD4和WNT2基因，形成一种全新的调控回路，在糖尿病引起视网膜血管功能障碍中发挥作用[35]。

图35 circHIPK3及相关通路在视网膜血管功能障碍中的作用（来自[35]）

circRNA MFACR竞争性结合miR-652-3p抑制MTP18的翻译

5月12日，Nature子刊Cell Death & Differentiation杂志在线发表了青岛大学医学院李培峰教授和中国医学科学院北京阜外医院张宇辉为共同通讯作者的文章，介绍发现环形RNA MFACR通过竞争性结合miR-652-3p抑制MTP18的翻译，进而抑制线粒体分裂并影响细胞凋亡作用，最终在人类心脏疾病中发挥作用[36]。

本文首先发现了心肌梗死（MI）标本中MTP18过表达，又通过预测分析和实验验证，找到miR-652-3p通过结合MTP18的3’UTR序列并进一步证明了miR-652-3p与MI中线粒体分裂和细胞凋亡的关系。miRNA Sponge是环形RNA的重要功能模型，于是作者继续寻找能竞争性结合miR-652-3p的环形RNA，首先基于数据库检索，找出MI特异性变化的环形RNA，然后通过PCR验证，最终发现了MFACR。最后实验结果表明在心肌缺血再灌注模型中MFACR通过竞争性结合抑制了miR-652-3p，而miR-652-3p通过结合MTP18的mRNA并抑制其翻译过程，MTP18蛋白则促进线粒体分裂和细胞凋亡作用，在心肌梗死中发挥重要作用[36]。本文的思路与绝大多数环形RNA研究的思路不同，先是找到了疾病相关的蛋白，然后又找到了对应的调控miRNA分子，最后才预测和鉴定到环形RNA。

图36 MFACR竞争性结合miR-652-3p在心肌梗死中发挥作用（来自[36]）

敲低circRNA有助于提高血管内皮细胞功能

7月8日，Theranostics在线发表了复旦大学眼耳鼻喉医院Yan Biao和南京医科大学第四临床医医院Jiang Qin为共同通讯作者的文章，介绍发现敲低circZNF609可改善血管内皮功能障碍[37]。

血管功能障碍与癌症等多种疾病有关，本文作者发现敲低circRNA-ZNF609可改善血管内皮细胞的功能障碍。在体内模型中，敲低circRNA-ZNF609可降低视网膜血管减少并抑制病理性血管异常。体外实验也表明敲低circRNA-ZNF609可促进血管内皮细胞的功能。机制方面作者发现circRNA-ZNF609可竞争性结合miR-615-5p[37]。

图37 体内模型中干扰circRNA-ZNF609促进血管内皮细胞功能 （来自[37]）

QKI蛋白通过调控circRNAs抑制化疗药物阿霉素介导的心脏损伤

11月13日，Circulation Research杂志在线发表了德国汉诺威医学院Shashi Kumar Gupta和Thomas Thum为共同通讯作者的文章，介绍发现QKI5介导的circRNAs形成作用参与抑制化疗药物阿霉素介导的心脏损伤[38]。

化疗药物阿霉素处理小鼠心肌细胞的实验模型中，研究者用全转录组高通量测序发现，5个RNA结合蛋白在此过程中发生了差异表达，其中QKI显著下调，响应阿霉素的作用最强烈。敲低QKI蛋白可增加阿霉素处理心肌细胞的凋亡和萎缩，而外源过表达QKI可逆转阿霉素的作用，体内实验同样发现该现象。进一步研究表明QKI5可调控Ttn, Fhod3, and Strn3基因起源的circRNAs分子来实现抑制阿霉素的作用[38]。

图38 QKI5调控circRNA生成抑制阿霉素的作用 （来自[38]）

其他circRNA与心血管疾病相关的研究报道 

2.3 circRNA与其他人类疾病 

除了肿瘤和心血管疾病，2017年还有许多人类疾病有circRNA的相关研究报道，由于体量巨大，我们只选择有代表性的几篇做简答介绍，后面会附上所有相关的文献的基本信息。

circ-ANXA2可作为多发性硬化症疾病标志物

6月23日，Human Molecular Genetics杂志在线发表了西班牙Biodonostia健康研究所Otaegui, David为通讯作者的文章，介绍在多发性硬化症（multiple sclerosis）中circRNA circ-ANXA2可作为疾病标志物的研究[39]。

多发性硬化症是一种自身免疫性疾病，本中作者基于芯片分析筛选了疾病相关的circRNAs，共找到了406种表达差异的circRNA。最终发现来源于ANXA2基因的circRNA可作为多发性硬化症的标志物[39]。

图39 circ-ANXA2可作为多发性硬化症的标志物（来自[39]）

circRNA与肝脏脂肪变性的关系

9月5日，Oxidative Medicine and Cellular Longevity杂志在线发表了上海交通大学新华医院范建高主任为通讯作者的文章，介绍发现肝脏脂肪变性中circRNA_0046367的变化情况及分子机制研究[40]。

作者在体外FFA诱导HepG2细胞脂肪性变模型中发现circRNA_0046367低表达，信息学分析及实验验证表明circRNA_0046367可以竞争性结合miR-34a，阻止其与靶分子PPARα的结合。脂肪性变的肝脏细胞中circRNA_0046367表达下降，释放miR-34a分子，进一步抑制PPARα的功能，促进脂肪代谢相关的基因表达，如CPT2，ACBD3等。而脂代谢带来的脂质过氧化作用会损伤线粒体，进而导致疾病。过表达circRNA_0046367能缓解该作用。

图40 circRNA_0046367竞争性结合miR-34a在肝脏脂肪变性中的作用 （来自[40]）

其他circRNA与人类疾病的相关报道

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