荐读 | 体外合成的circRNA可以用于肿瘤治疗？

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声 明

miRNAs通过直接碱基互补配对来结合或者剪切靶mRNAs，转录后调控基因的表达，从而在不同肿瘤类型中经常发挥着至关重要的作用。如果能够寻求一些方法，抑制miRNAs的功能，那么对于肿瘤治疗会有很大的帮助。已有研究报道，通过人工合成线性的miR-9 sponge，抑制miR-9的表达和功能，从而抑制高度恶性乳腺癌的转移；线性miR-135b sponge抑制miR-135b ，进而抑制肿瘤的生长、侵袭和转移。但是目前还没有研究人员利用人工合成的环形RNAs抑制miRNA，治疗肿瘤的案例。

由于天然的circRNAs具有抵抗外切酶消化和结合不同miRNAs后调节其功能的两大特性，来自美国约翰霍普金斯大学的Stephen J. Meltzer教授团队在体外合成可以结合miR-21的circRNA——scRNA21，发现其可以耐受核酸酶的降解，上调原本被miR-21靶向抑制的肿瘤抑制基因DAXX的表达，从而明显抑制高表达miR-21的胃癌细胞的增殖。该研究揭示了体外合成circRNAs sponge可作为抑制miRNA功能的快速、方便和有效的策略，同时也将可能应用于胃癌患者的肿瘤治疗。

1. TCGA数据库筛选与胃癌患者高度相关的miRNA，以作为circRNA的靶标

作者首先利用TCGA肿瘤数据库，挖掘到相比于正常人，胃癌患者中137种circRNAs表达上调，48种circRNAs表达下调，其中miR-21表达水平上调程度较大，约为1.76倍。同时体外通过qRT-PCR验证了相比于正常胃上皮细胞HFE145，胃癌细胞株NCI-N87、AGS 、MKN28和KATOIII中miR-21表达水平明显上调，后续实验将采用miR-21表达相对较高的NCI-N87、AGS 、MKN28细胞作为体外实验的细胞。

2. 体外设计合成针对miR-21的circRNA sponge ——scRNA21 

设计合成scRNA21的流程：首先设计含有5个重复的凸起的miR-21结合位点的线性scRNA21，overlap PCR后扩增为双链DNA，克隆连接到含有T7启动子的TOPO质粒载体上，利用T7 RNA聚合酶生成短RNA，小牛肠磷酸酶使RNA转录物的5'末端去磷酸化，并且T4多核苷酸激酶（在ATP存在情况下）产生适合连接的RNA分子，用T4 RNA连接酶孵育促使RNA环化，即形成scRNA21。

3. 验证体外合成的scRNA21

RT-PCR实验通过反向引物可以从scRNA21扩增出约为100 nt的条带，而线性RNA则无法扩增出这样的条带（A）。同时Sanger测序这大小为100 nt的产物，证实了scRNA21头尾连接位点的存在（B）。另外Sanger测序证实了反向引物扩增scRNA21后的产物存在5个重复的凸起的miR-21结合位点（黄色标记）（C）。

4. 检验scRNA21对FBS和RNase R的耐受程度

线性LRNA21在3% FBS中开始出现降解，在4% FBS中降解92%；而环状scRNA21相对位点，只有在7% FBS中才出现明显的降解（A）。在不同浓度的RNase R处理下，scRNA21明显抵抗RNase R的消化（B）。

5. 体外合成scRNA21的功能验证

在高表达miR-21的3个胃癌细胞株NCI-N87, AGS和MKN28中，转染含有或者不含有miR-21结合位点的荧光素酶报告基因质粒后，含有miR-21结合位点的质粒的相对荧光强度明显降低，基因表达受抑制，而当给予miR-21抑制剂或者scRNA21处理后，质粒的相对荧光强度明显恢复上调，提示scRNA21可充当miR-21抑制剂，发挥结合miR-21的功能，从而抑制miR-21的下游效应（A）。

由于miR-21高表达可以促进胃癌细胞的增殖，通过WST-1检测细胞增殖实验，发现miR-21抑制剂或者scRNA21处理可以明显抑制三种胃癌细胞的增殖（B）。

同时通过免疫荧光和共聚焦观察实验，发现在三种胃癌细胞中转染scRNA21后，细胞中的凋亡相关蛋白——剪切型caspase-3 的表达水平明显升高，提示scRNA21可以明显诱导胃癌细胞的凋亡（A-F）。

6. 筛选scRNA21结合miR-21后影响到的下游蛋白

既然致癌miRNA靶向结合mRNA后改变其下游蛋白的表达，那么scRNA21作为miR-21的sponge，很有可能会影响其下游蛋白的表达。作者转染scRNA21到细胞后，利用TMT标记蛋白进行全蛋白组分析了6341种蛋白，筛选miR-21直接结合的235种蛋白，其中19种蛋白的差异表达比较明显。相比于blank和nscRNA组，scRNA21组会上调原本被miR-21下调表达的蛋白（A-C）。

接着在COSMIC数据库验证这19种蛋白，发现只有肿瘤抑制蛋白DAXX出现在COSMIC数据库中，同时体外WB实验证实了scRNA21处理胃癌细胞8h后，肿瘤抑制蛋白DAXX表达水平明显上调，这提示了scRNA21可以恢复原本被miR-21抑制的肿瘤抑制蛋白的表达。

参考文献

1. Liu X, et al. Synthetic circular RNA functions as a miR-21 sponge to suppress gastric carcinoma cell proliferation. Molecular Therapy: Nucleic Acid. 2018. Doi: 10.1016/j.omtn.2018.09.010

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