荐读 | circ-Vav3与禽白血病病毒ALV-J诱导的肿瘤发生有关
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禽白血病是由逆转录病毒科禽白血病病毒和禽肉瘤病毒群中的病毒感染引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。该病既能水平传播又能垂直传播，可以造成多种类型肿瘤导致死亡,引起生产性能下降和免疫耐受，因此对养禽业的危害很大。根据禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)囊膜蛋白的不同、病毒干扰模式及宿主细胞的不同，可以分为A-J，10个亚群，其中A、B、C、D和J亚群为外源性ALV,E亚群为内源性ALV，以上6个亚群的病毒主要侵害鸡.而F、G、H和I等其他内源性ALV则存在于雉、鹧鸪、鹌鹑等鸟体内。禽白血病病毒J亚群（ALV-J)于1988年从肉鸡中分离鉴定出来，该病目前已经呈现世界性分布。我国于1999年首次在肉鸡中分离到ALV-J，2002年在蛋鸡中也发现了ALV-J的感染。随后我国各地相继出现从肉鸡、蛋鸡及地方品系鸡中分离到ALV-J的报道，其病理学特征主要是：骨髓、肝、脾、心、肾、睾丸（或卵巢）等组织出现髓细胞样瘤细胞。ALV-J可引起多种肿瘤，如骨髓细胞瘤，肉瘤，血管瘤，肾瘤和成红细胞增多症，以及骨髓白血病，导致感染鸡的死亡率很高。该分散的ALV-J菌株的广泛分布造成了巨大的经济损失，并且根除ALV-J仍然是一项重大挑战。我们对ALV-J诱导的肿瘤发生机制仍然不清楚。
鸟嘌呤核苷酸交换因子VAV3（vav 3 guanine nucleotide exchange factor）是由VAV3基因编码的蛋白质。该基因是VAV基因家族的成员。VAV蛋白是Rho家族GTP酶的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），其激活的通路导致肌动蛋白细胞骨架重排和转录改变。该基因产物作为GEF，优先作用于RhoG，RhoA和较小部分的RAC1，并且它与这些无核苷酸状态的GTP酶的结合能力最强。 该基因可形成选择性剪接转录变异体，编码不同的亚型。
最近来自华南农业大学动物科学学院的谢青梅教授研究团队最近在RNA Biol（IF=5.216）上在线发表了题为Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition的研究[1]，首次报道了感染了逆转录病毒ALV-J的鸡禽类的肿瘤肝中存在表达水平上调的circ-Vav3。因为通讯作者之前的研究工作发现，在感染了ALV-J的鸡禽类的肝肿瘤中，通过microRNA芯片结果检测显示gga-miR-375的表达水平明显下调，带着gga-miR-375是否与某种circRNAs有直接联系的疑问，作者证明了circ-Vav3可以结合和海绵gga-miR-375，上调gga-miR-375靶向的基因YAP1的表达，从而调控EMT相关基因的表达，诱导EMT的发生，这些结果提示circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴对于ALV-J诱导的肿瘤发生有着重要的意义。
作者之前的研究[2]，通过miRNA芯片分析被ALV-J感染的鸡肝中miRNA的表达情况，发现gga-miR-375的表达水平下调程度最明显。在这次研究中，作者也通过circRNA芯片分析同样被ALV-J感染的鸡肝，检测了13419种circRNAs。相比于正常的鸡肝，有2822种circRNAs出现差异性表达，其中2808种circRNAs表达出现显著性上调。热图对被ALV-J感染的鸡肝中前25种表达上调的circRNAs进行分析，其中circ-Vav3 (chr8:1033880-1047222-)表达上调的水平最高；同时利用TargetScan和miRanda对这前25种表达上调的circRNAs可能结合的miRNAs进行预测和基因互作网络的分析，每种circRNA对应5种最有可能结合的miRNA，其中circ-Vav3(chr8:1033880-1047222-)可能结合gga-miR-375的评分最高。
UCSC 基因组浏览器对circ-Vav3进行注释，揭示了circ-Vav3来源于Vav3基因的8-11号外显子；生物信息学分析显示，gga-miR-375与circ-Vav3之间存在完美的靶向结合位点；AGO2可以介导circRNAs与miRNAs的结合，因此RIP实验利用AGO2抗体捕获了ALV-J感染的鸡肝上清中AGO蛋白后，RT-qPCR检测发现gga-miR-375和 circ-Vav3的明显富集；同时利用特异性circ-Vav3探针进行的pull-down实验，也证明了circ-Vav3可以捕获和结合gga-miR-375。RNA-FISH实验证明了circ-Vav3主要存在于胞浆，而gga-miR-375既存在胞浆，也存在于胞核，也证明了两者的共定位，提示了在胞浆circ-Vav3与gga-miR-375相互结合发挥生物学功能。
通过miRanda和Targetscan预测分析了YAP1是gga-miR-375潜在的靶向基因；luciferase reporter实验证明了gga-miR-375可明显抑制YAP1 3’UTR的荧光素酶活性；在鸡成纤维细胞系DF-1中，过表达gga-miR-375明显下调了YAP1蛋白和 mRNA的表达水平，提示gga-miR-375通过直接结合YAP1 3’UTR，抑制YAP1的表达。
EMT现象一般是肿瘤发生转移的前兆，伴随着N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1和Vimentin基因的表达上调和E-cadherin的表达下调。为了评估gga-miR-375是否会影响EMT进程，发现过表达gga-miR-375可以显著地上调了EMT正相关的基因N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1和Vimentin蛋白和 mRNA的表达，而下调了E-cadherin蛋白和 mRNA的表达。miRanda和Targetscan预测分析显示N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1和Vimentin都不是gga-miR-375的直接靶基因，这些结果提示了gga-miR-375通过抑制YAP1的表达，抑制EMT的发生。
为了研究YAP1对DF-1细胞迁移能力的影响，作者利用Transwell实验证明过表达YAP1明显提高细胞的迁移能力；由于YAP1对于肿瘤的维持至关重要，而EMT在肿瘤细胞发生迁移和在上皮细胞中YAP1的表达上调过程中，起着至关重要的作用，增加肿瘤相关成纤维细胞的数量，那么YAP1过表达是否可诱导DF-1细胞发生EMT？WB和RT-qPCR实验证明了YAP1过表达显著地上调了EMT正相关的基因N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1和Vimentin蛋白和 mRNA的表达，而下调了E-cadherin蛋白和 mRNA的表达，提示YAP1可促进EMT的发生和细胞迁移能力。
一般circRNAs结合miRNAs，调控miRNAs的靶基因的表达，影响其下游的信号通路。作者猜测circ-Vav3在胞浆海绵gga-miR-375，从而影响YAP1和其相关的EMT marker基因的表达。相比于过表达gga-miR-375和LCDH-circ-EV组，过表达gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3组的Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin的蛋白和 mRNA表达水平明显上调，而E-cadherin的蛋白和 mRNA表达水平明显下调，进一步提示了circ-Vav3在功能上可以海绵gga-miR-375，上调其靶基因YAP1的表达，诱导EMT的发生。
为了评估ALV-J病毒对于circ-Vav3, gga-miR-375, YAP1 和 EMT-相关基因表达的影响，利用ALV-J病毒株NX0101感染DF-1细胞后，细胞中circ-Vav3表达水平明显上调，而gga-miR-375的表达水平明显下调；WB和RT-qPCR实验分析显示NX0101感染细胞，可以显著地上调YAP1, Vimentin, ZEB1, MMP2, Fibronectin 和N-cadherin的蛋白和 mRNA表达水平，而下调E-cadherin的蛋白和 mRNA表达水平。
对从鸡养殖场收集的临床样本——肿瘤鸡肝进行RT-qPCR分析，同样地发现circ-Vav3，YAP1, Vimentin, ZEB1, MMP2, Fibronectin 和N-cadherin的表达水平明显上调，而E-cadherin和gga-miR-375的表达水平明显下调。
参考文献
1. Zhang X, et al. Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition. RNA Biol. 2019 Jan 4. doi: 10.1080/15476286.2018.1564462.
2. Li H, Shang H, Shu D, et al. gga-miR-375 plays a key role in tumorigenesis postsubgroup J avian leukosis virus infection. PLoS One. 2014;9:e90878.
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