研究策略 | 新一代circRNA pull-down技术

欢迎个人转发到朋友圈，公众号、自媒体、网站等媒体转载请联系授权，[e-mail]。

生物分子发挥作用往往通过与其它分子的相互作用实现，circRNA作为细胞内广泛存在且高度多样性的分子，研究其与其它分子的相互作用，包括动态调控过程是认识其功能的重要突破口。

目前对circRNA的研究主要集中在其与miRNA或蛋白的相互作用，相关的实验技术有RNA原位杂交、荧光素酶报告基因检测、RIP技术、RNA pull-down技术等。其中RNA pull-down技术，不仅能够对可能存在相互作用的分子进行验证，还可以实现对未知相互作用分子的探索，在circRNA功能研究中有着独特的优势。

01

circRNA pull-down技术现状

现在常用的circRNA pull-down 技术借鉴了传统lncRNA的技术原理，主要分为两类：

▶ 线性RNA替代法：运用体外转录的方法获得一段与circRNA序列完全相同的线性RNA作为circRNA的替代物，并进行标记作为探针；使用探针与细胞裂解液进行孵育，来捕获可能与circRNA互作的miRNA或蛋白。该方法忽略了circRNA的环状结构特征，影响了结果的可靠性。

▶ 探针钓取法：设计合成1条或几条与circRNA接口位置互补结合探针分子，通过探针对细胞内源性circRNA以及与circRNA结合的分子复合物进行捕获。

由于circRNA与来源基因的差别仅仅体现在接口位置（splicing junction），探针只能设计在跨接口位置，才能够保证其特异性。

理论上靶向接口位置的探针可以有效的捕获靶分子，但实践过程中，探针设计位置的局限性也限制了探针序列设计的选择，经常会遇到无法设计出有效的捕获探针的情况。同时，在后续捕获实验的过程中，保持探针分子的有效结合与尽量洗去非特异性结合的分子是一对矛盾的需求，为了更特异性的获得靶分子及相互作用的分子，需要尽量用更强的洗脱条件，而洗脱条件太强又有可能导致探针与靶分子脱离，导致信号下降。

因此在实施过程中，如何设计出高效特异的探针，并控制合适的条件是技术面临的巨大挑战。而对于某些依赖接口位置的相互作用分子，探针与它们之间竞争性结合，可能得到假阴性的结果。

此外，对同源性较高或表达丰度较低的circRNA，这类技术并不适用，而circRNA的表达丰度普遍比较低这一事实，更为此项技术增加了一道障碍。

为了弥补现有技术的不足，吉赛生物依托在circRNA研究方面多年技术积累，研发出了新一代的circRNA pull-down技术，可对大部分circRNA实现高效率、强特异性的捕获。

02

新一代circRNA pull-down技术路线

本项技术在吉赛生物circRNA过表达载体技术基础上，将RNA标签体系引入circRNA中，实现在细胞内表达带有特异性标签的circRNA；通过RNA标签与捕获蛋白的高度特异且稳定的相互作用，进行circRNA和与其相互作用分子的捕获；再对捕获产物检测，从而鉴定出可能与circRNA相互作用的蛋白或者miRNA分子。

新一代circRNA  pull-down技术示意图

03

新一代circRNA pull-down技术优势

该体系的优势包括：

▶ 实验体系捕获的是环形的circRNA分子，更能模拟circRNA的天然形态，相对“线性RNA替代法”可信度更高；

▶ 通过circRNA过表达载体引入外源标签，可降低来源基因的背景干扰；

▶ RNA标签与捕获蛋白间的相互作用远远强于探针分子的捕获作用，相比于30nt左右的探针，其特异性也高得多，能够更高效的捕获靶分子；   

▶ RNA标签插入的位置可根据实际情况灵活设计，能有效避免竞争性探针导致的junction位置相互作用分子信息的丢失问题；

▶ 不依赖于细胞内本底表达的circRNA量，对细胞内表达丰度低的circRNA同样适用。   

考虑到引入的标签序列可能会对原分子的高级结构产生影响。在具体实验中，我们可以通过实验设计降低或避免这一点，主要的做法是基于信息学预测miRNA或蛋白结合位点，设计插入位点避开这些可能的结合位点，以降低对circRNA与目标分子相互作用的影响，还可以通过平行设计不同插入位点的方法避免单个插入位点造成的影响。最后，鉴定得到的相互作用分子需要进行内源验证，以避免引入的标签带来的假阳性信息。

04

使用RNA标签

进行circRNA pull-down的案例分享

▶ circRNA pull-down技术在circRNA与蛋白间相互作用研究中的应用

在2016年Nature Communication杂志上发表了一篇关于circANRIL在动脉粥样硬化这一疾病中功能研究的文章中[1]，作者使用了RNA标签BoxB对circANRIL进行了标记，在工具细胞293T中进行pull-down实验。

作者对pull-down获得的蛋白进行质谱分析，结果显示，circANRIL结合蛋白中有38%与核糖体的形成有关，16%的蛋白参与了细胞内RNA的剪切调控[1] 。这一结果为作者的后续研究提供了重要的指示，预测circANRIL与核糖体RNA形成可能存在密切关系，同时也是一个强有力的证据。

circANRIL pull-down获得的蛋白质谱分析[1]

▶ circRNA pull-down技术在circRNA与miRNA间相互作用研究中的应用

2017年Journal of Experimental & Clinical Cancer Research杂志上发表的文章中，作者使用了MS2序列作为circRNA标签，在不同的乳腺癌肿瘤细胞中研究circRNA sponge功能。

作者在circGFRA1中引入了MS2序列标签，分别在MDA-MB-231、MDA-MB-486和BT549 这3株三阴性乳腺癌细胞中进行了pull-down，对circGFRA1进行富集，发现在circGFRA1富集产物中miR-34a也存在明显的富集情况[2]。随后一系列的实验结果证明，circGFRA1通过吸附miR-34a对其下游基因的表达进行调控，从而实现对肿瘤细胞增殖的促进作用。

circGFRA1富集产物中与miR-34a也存在明显的富集情况[2]

参考文献

1. Holdt, L.M., et al., Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans. Nat Commun, 2016. 7: p. 12429.

2. He, R., et al., circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triple negative breast cancer by regulating miR-34a. J Exp Clin Cancer Res, 2017. 36(1): p. 145.

近

期

热

文

“circRNA”微信公众平台由

『广州吉赛生物科技股份有限公司』运营，

旨在为circRNA研究同行

提供最新科研资讯和研究方法，

服务广大生命科学工作者和医学工作者。

如果您有好的文章或Idea，

千万别让它埋没，

欢迎大家分享或投稿。

小编在编辑微文时特别鸣谢，

另有惊喜送出！

投稿邮箱：[e-mail]

点击下方图片，长按扫描并关注，一起涨知识吧！

点击“阅读原文”