circβ-catenin翻译蛋白产生的“正反馈”效应

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今天分享的是一篇最近发表在Genome Biology(IF=12.66)上的有关circβ-catenin翻译蛋白正反馈激活Wnt信号通路的研究，通讯作者为广州中医药大学第一附属医院的Jin-Fang Zhang、南方医科大学药学院的Wei-Ming Fu和中山大学附属第三医院的Qi Zhang。

考虑到Wnt/β-catenin信号通路在肝癌发生过程中的重要性，作者选择了该通路相关的143个基因，利用了circBase数据库分析了这些基因可以产生的circRNAs。体外分析了7种非肿瘤细胞和6种肿瘤细胞，发现了大部分细胞都能产生数百种Wnt通路相关的circRNAs。作者在聚焦HepG2肝癌细胞，48种Wnt通路相关基因可产生131种circRNAs。基于β-catenin是Wnt通路的主要调控者，是唯一一个在多个测序数据结果中均能检测到的circRNA，而且在肝癌组织中其拷贝数目经常出现增加的特性，作者筛选出β-catenin来源的circRNA——circβ-catenin，其主要存在细胞胞浆中。通过qRT-PCR检测，发现在不同人组织中circβ-catenin和β-catenin mRNA的表达水平呈现正相关的关系。

circβ-catenin的表达水平在肝癌组织和肝癌细胞系中明显上调，为进一步了解circβ-catenin在肝癌发生中发挥的作用，利用shRNA敲低circβ-catenin表达，在不影响正常β-catenin mRNA表达水平基础上，体外MTT实验、克隆形成实验、流式周期分析、迁移和侵袭实验证明，敲低circβ-catenin表达后细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显降低，细胞阻滞在G1/S期。如果同时过表达circβ-catenin，则会rescue这些表型；但是过表达携带突变启动子的circβ-catenin载体，则无法rescue这些表型，说明能否rescue成功有可能取决于circβ-catenin编码蛋白的功能。

利用circβ-catenin稳定敲低的Huh7细胞株，建立在裸鼠皮下成瘤、在肝组织原位成瘤和在尾静脉注射后观察肺转移等模型，发现敲低circβ-catenin表达可以明显抑制肿瘤细胞在体内的生长和转移。

经生信分析和qRT-PCR验证，敲低circβ-catenin表达影响到的基因主要参与Wnt/β-catenin信号通路。敲低circβ-catenin表达可影响circβ-catenin表达和β-catenin蛋白水平，而不影响β-catenin mRNA水平，提示circβ-catenin可能调控β-catenin转录后翻译或者降解的过程。荧光素酶报告基因实验证明，与敲低β-catenin mRNA表达的结果一致，敲低circβ-catenin表达可以抑制β-catenin的结合作用。同时敲低β-catenin或者circβ-catenin表达均可抑制β-catenin靶基因的表达，提示circβ-catenin调控β-catenin表达，进而影响β-catenin靶基因的表达。

经生信预测分析，circβ-catenin含有一个内部核糖体进入位点IRES，有可能编码长度为370aa的新型β-catenin蛋白。β-catenin-370aa含有与正常β-catenin一样的N端氨基酸序列，但它的C端 含有9个特异的新氨基酸。利用识别N端序列的β-catenin抗体IP下来后进行质谱分析，证实了这种β-catenin-370aa蛋白的存在。免疫荧光实验证明β-catenin-370aa蛋白主要定位在胞浆。Dual-Luciferase报告系统证明，circβ-catenin中的推测IRES序列具有启动基因翻译的能力。

从前面的结果提示circβ-catenin可能调控β-catenin转录后翻译或者降解过程，β-catenin的稳定性与其磷酸化状态紧密相关。因为GSK3β磷酸化β-catenin的Ser33/Ser37/Thr41位点后，β-catenin被泛素连接酶泛素化后经蛋白酶体降解。敲低circβ-catenin表达可明显降低β-catenin的Ser33/Ser37/Thr41位点的磷酸化水平。另一方面，由于GSK3β主要通过结合β-catenin的N端发挥作用，而circβ-catenin翻译的蛋白β-catenin-370aa也包含N端同源序列，co-IP实验进一步证明GSK3β也与β-catenin-370aa存在相互结合，而敲低circβ-catenin表达则增强GSK3β与全长β-catenin蛋白的结合，促进β-catenin的泛素化，过表达β-catenin-370aa则抑制两者的结合，提示circβ-catenin可能通过抑制β-catenin泛素化，增强其稳定性。总之，这些结果提示了circβ-catenin编码的β-catenin-370aa可能通过竞争性抑制GSK3β对全长β-catenin的磷酸化后的泛素化降解。

小结：本文的研究鉴定了致癌基因β-catenin来源的环状RNA——circβ-catenin，首次报道circβ-catenin编码了新型的β-catenin-370aa蛋白，竞争性抑制GSK3β磷酸化后导致β-catenin的降解，导致Wnt/β-catenin通路的不断活化，形成“正反馈“效应，促进肝癌细胞的生长增殖和转移，也是本文的一大亮点。但是缺点在于体外探讨的分子机制没有在体内肿瘤模型中得到很好的验证，也没有对circβ-catenin是否会通过sponge或者调控基因转录方面的功能进行深入的探讨和排除。

参考文献列表

1. Liang WC, Wong CW, Liang PP, et al. Translation of the circular RNA circβ-catenin promotes liver cancer cell growth through activation of the Wnt pathway. Genome Biol. 2019 Apr 26;20(1):84. doi: 10.1186/s13059-019-1685-4.

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