FASEB Journal：circ-Ankib1调控施万细胞增殖

欢迎个人转发到朋友圈，公众号、自媒体、网站等媒体转载请联系授权，[e-mail]。

8月23日，发表在The FASEB Journal期刊（IF=5.391）的一篇circRNA研究论文，报道了在施万细胞富集的一个circRNA circAnkib1调控周围神经损伤后施万细胞的增殖。文章的通讯作者是来自江苏省教育部神经再生重点实验室，南通大学神经再生联合创新中心的于彬教授。

施万细胞在神经损伤修复中起重要作用。细胞对周围神经损伤反应的一个显著特征是施万细胞的增殖。circRNAs在神经系统中富集并参与生理和病理过程。然而，circRNAs在神经损伤后施万细胞增殖中的潜在作用仍然很大程度上未知。使用坐骨神经挤压伤模型，作者通过RNA测序和生物信息学分析获得大鼠受损坐骨神经中circRNAs的表达谱，并且进一步鉴定了一个circRNA，circ-Ankib1通过特异性siRNA的转染参与施万细胞增殖。在施万细胞中特异性和高度富集的circ-Ankib1的过表达损害坐骨神经损伤后损害的增殖和轴突再生。在机制上，损伤后DEx / H-box解旋酶9（DHX9）的表达增加可能有助于下调circ-Ankib1，其通过海绵miR-423-5p，miR-485-5p和miR-666-3p，进一步抑制细胞色素P450家族的Cyp26b1的表达，导致施万细胞增殖和神经再生的诱导。总之，本研究揭示了circRNAs在调节参与坐骨神经再生的施万细胞增殖中的关键作用。

鉴定坐骨神经受到挤压伤后表达的circRNAs

为了鉴定参与坐骨神经损伤修复的功能性circRNAs，本文首先在损伤后的不同时间点（0，1，4，7和14天）获得了压碎坐骨神经的总RNA，用于RNA-Seq。通过Tophat2和CIRI2的生物信息学分析，总共检测到7651个circRNAs，其中62.6%为外显子circRNAs，28.4%为基因间circRNAs，9.0%为内含子circRNAs。其中，有980个差异表达的circRNAs（FDR < 0.05）。考虑到长度较大的外显子circRNAs可能具有更丰富的功能，我们按照长度大于500 nt的标准选择了26个候选circRNAs。通过PCR，琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序实验技术，本文验证了7个circRNAs的存在，分别为circ-Crebbp，circ-Setd5，circ-Myo9a，circ-Ankib1，circ-Magi2， circ-Zbtb20和circ-Nr2f1。然后，通过qRT-PCR发现，circ-Crebbp的丰度显著增加，而其他circRNAs的丰度均在坐骨神经损伤后减少，并且在4天左右达到其最低水平。这些显著的表达变化表明这些circRNAs可能在坐骨神经损伤修复中起关键作用。

图1 通过RNA-Seq分析鉴定受损大鼠坐骨神经中的circRNAs

如何筛选参与施万细胞增殖的circRNAs？

由于参与施万细胞增殖的调节因子在坐骨神经压迫后4天表达量达到峰值，为了鉴定参与施万细胞增殖的候选circRNAs，本文首先选择了在损伤后4天表达量达到峰值的6种circRNAs，并检测了它们在纯化的原代施万细胞中的表达水平。其中，circ-Ankib1和circ-Setd5在施万细胞中具有相对较高的表达水平。为了确定circ-Ankib1和circ-Setd5在原代施万细胞增殖中的作用，本文设计了特异性siRNA，这些siRNAC仅降低了特定的circRNA表达，但没有降低其相应宿主基因线性RNA的表达。EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）测定结果显示，特异性siRNA抑制circ-Ankib1表达，诱导了施万细胞的增殖，但circ-Setd5下调后施万细胞增殖没有显著变化，这表明circ-Ankib1可能是坐骨神经损伤后施万细胞增殖的候选调节因子。

图2 筛选调节施万细胞增殖的circRNAs

Circ-Ankib1是一种高度富集并在施万细胞中特异性表达的circRNA

Circ-Ankib1来自基因Ankib1的第2-5个外显子，耐受RNase R。与随机六聚体引物相比，当使用oligo（dT）18引物时，circ-Ankib1的相对表达水平显著降低，而lin-Ankib1的相对表达水平没有明显变化，表明circ-Ankib1确实没有poly-A尾巴。为了确定circ-Ankib1是否特异性地在坐骨神经中富集，本文检测了各种组织中circ-Ankib1的表达水平，发现其在坐骨神经中高度富集，并且几乎完全位于坐骨神经的施万细胞中，而不在轴突中。此外，qRT-PCR和FISH测定结果表明， circ-Ankib1主要分布在施万细胞的细胞质质中。总之，这些结果证明circ-Ankib1是环状且稳定的RNA，其在坐骨神经中高度富集并且特异地位于施万细胞中。

图3 circ-Ankib1的特征

Circ-Ankib1损害了受损后坐骨神经的施万增殖和轴突再生

为了进一步确定circ-Ankib1在坐骨神经损伤修复中的作用，作者通过慢病毒转染SOX10阳性的原代施万细胞，使circ-Ankib1的表达水平上调5.70倍。EdU测定结果显示circ-Ankib1的过表达减弱了原代施万细胞的增殖。然后，作者将Lv-circ-Ankib1（含有circ-Ankib1的腺病毒）注射到坐骨神经中，并在14天后压碎坐骨神经。与lv-Ccon组相比，过表达circ-Ankib1后抑制了损伤后3天的细胞增殖。GAP-43在损伤后的坐骨神经再生纤维中被高度诱导，因此作者通过GAP-43的免疫组织化学实验测定坐骨神经中的轴突再生，结果表明circ-Ankib1减弱了轴突再生。

图4 Circ-Ankib1减弱坐骨神经损伤后的施万细胞增殖和轴突再生

为了检测Ankib1的线性mRNA（lin-Ankib1）是否与circ-Ankib1在施万细胞增殖中具有相似的作用，作者首先确定了lin-Ankib1在坐骨神经损伤后的表达变化，发现其变化不如circ-Ankib1显著。然后，作者通过特异性siRNA敲低lin-Ankib1的表达，其仅降低lin-Ankib1的水平但不能降低circ-Ankib1的水平。EdU测定发现，lin-Ankib1对施万细胞增殖没有任何影响。这些数据表明circ-Ankib1代替lin-Ankib1可以抑制施万细胞增殖，导致轴突再生受损。

图5 lin-Ankib1的下调对体外施万细胞增殖没有影响

Circ-Ankib1如何调控施万细胞的增殖？

鉴于细胞质中的circRNA通常作为miRNA的海绵起作用，作者通过miRanda软件共预测29个候选miRNAs。一些报道表明，circRNA可以作为竞争性内源性RNA（ceRNA），影响miRNA对其靶基因的负调控。然后作者对特异性circ-Ankib1 siRNA转染的施万细胞进行RNA-seq，鉴定了120个下调表达的基因，并将这些基因用miRanda软件预测上述29个候选miRNA的结合位点，结果获得了50个候选靶基因构成ceRNA网络。其中，4个基因（Cyp26b1，Rasd1，Npy1r和Rbm24）被报道参与细胞增殖。qRT-PCR检测显示，这4个基因在坐骨神经损伤后均下调表达，并且与circ-Ankib1具有相似的趋势；在特异性circ-Ankib1 siRNA转染的施万细胞中，Cyp26b1，Rasd1和Npy1r的表达水平也显著降低。这些结果表明circ-Ankib1可能作为Cyp26b1，Rasd1和Nyp1r的ceRNA。

然后，作者试图验证circ-Ankib1，miRNA和靶基因之间的直接结合关系。作者构建了circ-Ankib1荧光素酶质粒（pmirGLO-circ-Ankib1）并进行了荧光素酶检测，结果表明，在与上述3个靶基因相关的9个miRNAs中，miR-103-3p，miR-423-5p，miR-541 -5p，miR-666-3p和miR-485-5p显著降低了pmirGLO-circ-Ankib1的荧光素酶活性，表明circ-Ankib1可能直接与这5个miRNAs相互作用。随后，作者构建了Cyp26b1，Rasd1或Npy1r的3’UTR的荧光素酶载体，并进行荧光素酶测定，结果表明只有Cyp26b1 的3’UTR可以直接与miR-423-5p结合，miR-666 -3p和miR-485-5p。然后我们分别突变Cyp26b1 的3’UTR中与miR-423-5p，miR-666-3p和miR-485-5p的靶位点，构建到荧光素酶载体上。转染相应的miRNA后，发现荧光素酶活性与对照相比均没有显著变化，进一步证明了miR-423-5p，miR-666-3p和miR-485-5p与Cyp26b1直接相互作用。

接下来，为了验证circ-Ankib1是否作为AGO2和miR-423-5p，miR-485-5p和miR-666-3p结合的平台，作者在miR-423-5p，miR-485-5p，miR-666-3p或阴性对照miRNA转染的施万细胞中进行AGO2免疫沉淀，结果发现，在miR-423-5p，miR-485-5p或miR-666-3p转染的施万细胞中，在AGO2下拉样品中可清楚地检测到内源性circ-Ankib1，而在阴性对照miRNA转染的细胞中几乎检测不到，并且在所有的样品中都未检测到lin-Ankib1。这表明miR-423-5p，miR-485-5p和miR-666-3p促进了AGO2与circ-Ankib1的结合，而不是与lin-Ankib1的结合。另外，FISH实验表明circ-Ankib1和上述3个miRNAs有共同定位。蛋白质免疫印迹实验显示，miR-423-5p，miR-485-5p和miR-666-3p降低了原代施万细胞中Cyp26b1的蛋白质水平。结果表明，miR-423-5p，miR-485-5p和miR-666-3p可以调节施万细胞中Cyp26b1的表达。总之，这些结果表明，circ-Ankib1可以直接与miR-423-5p，miR-485-5p和miR-666-3p结合，并作为这三个miRNAs的 海绵调节Cyp26b1的表达。

图6 Circ-Ankib1可通过与miR-423-5p，miR-485-5p和miR-666-3p结合来调节Cyp26b1的表达

circ-Ankib1的形成受什么调控？

Cyp26b1的下调增强了施万细胞的增殖。此外，在过量表达circ-Ankib1的施万细胞中，Cyp26b1的下调可以挽救Lv-circ-Ankib1对施万细胞增殖的抑制作用，这些数据表明，circ-Ankib1通过调节Cyp26b1调节施万细胞的增殖。

为了探索circ-Ankib1的上游分子，作者检测了受伤后坐骨神经中3个RNA结合蛋白（RBPs）的表达变化。qRT-PCR实验表明，损伤后坐骨神经中3个RBPs均显著改变，表明它们可能在神经损伤修复中起关键作用。由于circ-Ankib1的表达水平从损伤后1天显著降低，因此选择在伤后1天也明显变化的DHX9和QKI进行进一步研究。在施万细胞中只敲除DHX9而不敲除QKI，circ-Ankib1的丰度显著增加。有研究报道，DHX9可以通过与侧翼内含子中的反向互补序列结合来抑制circRNA的产生，从而阻止RNA双链体的形成，因此作者研究了circ-Ankib1是否以这种方式受到调控。通过使用YASS将Ankib1基因的内含子1和内含子5的序列进行相似性比对以确定彼此反向互补的序列，结果发现在内含子1和内含子5中发现了2对反向互补序列，其中命名为I1RC-1-I1RC-2和I5RC-1-I5RC-2的得分最高。RIPA实验表明，这两对互补序列显著富集。这些结果表明，DHX9可通过与坐骨神经损伤后内含子1和内含子5中的反向互补序列结合来抑制circ-Ankib1的产生。

图7 DHX9-circ-Ankib1-miR-423-5p / miR-485-5p / miR-666-3p-Cyp26b1调节坐骨神经损伤后的施万细胞增殖

图8 circ-Ankib1影响坐骨神经损伤后施万细胞增殖的模式图

参考文献：

1.  Mao, S., Zhang, S., Zhou, S., Huang, T., Feng, W., Gu, X., Yu, B. A Schwann cell–enriched circular RNA circ-Ankib1 regulates Schwann cell proliferation following peripheral nerve injury. FASEB J. 33, 000–000 (2019). www.fasebj.org

近

期

热

文

“circRNA”微信公众平台由

『广州吉赛生物科技股份有限公司』运营，

旨在为circRNA研究同行

提供最新科研资讯和研究方法，

服务广大生命科学工作者和医学工作者。

如果您有好的文章或Idea，

千万别让它埋没，

欢迎大家分享或投稿。

小编在编辑微文时特别鸣谢，

另有惊喜送出！

投稿邮箱：[e-mail]

点击下方图片，长按扫描并关注，一起涨知识吧！

点击“阅读原文”