人工设计环状RNA作为miRNA抑制剂治疗心肌肥大

2020年4月4日，新加坡国立大学Matthew Ackers-Johnson和Roger S-Y Foo为共同通讯作者在Molecular Therapy预先发表了一篇题为“Engineered circular RNA sponges act as miRNA inhibitors to attenuate pressureoverload induced cardiac hypertrophy”的文章，阐述了一种针对心室肥大高效又稳定的新型治疗策略，即人为构建可以靶向降解miR-132 / 212家族的circRNA海绵（circmiR），向心肌细胞递送circmiR，使肥厚性疾病特征减弱，心功能得以稳定（[1]）。

心力衰竭是很多心血管疾病晚期的共同特征，它在全世界都有着高发病率和死亡率，并构成重大的医疗负担，迫切需要新的治疗方法。miRNA在正常发育和动态平衡中起着至关重要的作用，其失衡涉及各种疾病的发病机制。因此，靶向miRNA是一条可利用的治疗途径。circRNA的经典功能是作为miRNA海绵，如果circRNA作为药物，可以解决半衰期短、脱靶效应和非代谢分子积累等传统药物缺点。

 1

circRNA海绵（circmiR）序列的设计

已知miR-132/212可以推动心脏病理性肥厚，设计可以降解miR-132/212的circRNA海绵（circmiR）。设计针对miR-132-3p完全匹配和不完全匹配的miRNA结合位点（MBS）。不完全匹配的MBS是不与miR-132-3p的9-12nt结合。设计的circRNA海绵交替与miR-132和miR-212结合，miRNA结合位点之间有6个核苷酸（nt）的裂缝，即不与miRNA结合的区域。为了使circRNA海绵环化，在它的两侧添加较长的反向互补内含子，使用发散引物的实时定量聚合酶链反应（qPCR）检测circmiR的头尾连接，并通过Sanger测序进行了验证。

图1 circmiR的设计和验证

 2

circmiR的功能测试与优化

使用双萤光素酶报告基因实验，证实设计的MBS对miR-132和miR-212有抑制作用。接下来，通过测试MBS不同间隔区长度，结合类型和总数的海绵作用来优化circmiR结构。设计miRNA结合位点间隔为6、12、24、36和72核苷酸，并验证它们对miR-132/212的抑制作用，12核苷酸的间隔显示出最好的效果。设计不同长度的MBS，随着MBS长度的增加，对miRNA的抑制作用在加强，12个核苷酸MBS达到峰值。检测完全和不完全匹配MBS的抑制作用，结果表明不完全匹配MBS抑制作用更强。然而，完全匹配MBS可以被miRNA降解。以上实验在大鼠的心肌细胞中执行，结果同上。得出一个最佳的circmiR，具有12个核苷酸间隔和12个核苷酸不完全匹配的MBS。

图2 circmiR设计的优化

 3

体内circmiR给药可减轻小鼠TAC模型诱导的疾病

作者验证了miR-132和miR-212在横向主动脉缩窄（TAC）心脏超负荷小鼠模型中上调。在TAC处理前一周，腹腔注射腺相关病毒，使心肌细胞（CM）转入circScram, circmiR和线性miR-132/212海绵，TAC处理后来观察各组心脏的受损情况。circmiR和线性miR-132/212海绵组小鼠与circScram组小鼠比较，室间隔（IVS）和左室后壁（LVPW）的厚度薄、心脏功能得以保留并且病理性肥大明显减轻。表明，circmiR具有与线性miR-132/212海绵一样的功能，可以治疗心脏功能受损。有趣的是，在circmiR和线性miR-132/212海绵组中miR-132和miR-212的丰度明显更高。这可能是由于螯合的miRNA保留而没有被降解引起的。

图3 circmiR可以减轻心力衰竭

 4

体外检测circmiR的疗效及其稳定性

利用排列内含子-外显子的方法在体外合成circmiR，顺序是5’端内含子-外显子1-miRNA海绵序列-外显子2-3’端内含子。随后，circmiR在体外转录和纯化，与antagomir比较对miRNA的抑制效果。antagomir为miRNA拮抗剂，可以治疗心肌肥厚，正在进行一期的临床试验。双萤光素酶报告基因显示，circmiR相比于antagomir和线性miRNA海绵，对miRNA的抑制更显著。circmiR的疗效是antagomir的两倍。因此，体外试验表明，合成的circmiR比antagomir疗效更加显著。

最后，证实circmiR的稳定性。HEK293T细胞转染circmiR或线性miRNA海绵的表达质粒，转染人工合成circmiR或线性miRNA海绵。用放线菌素D处理，在指定时间点测量两者的表达量，绘制circmiR和线性miRNA海绵随时间的变化图。在处理72小时，不管是人工合成还是质粒表达的circmiR都未曾被降解，相比较于线性miRNA海绵有更好的稳定性。

图4 人工合成circmiR及其疗效

图5  circmiR比较线性miRNA海绵更加稳定

参考文献

1. Lavenniah A, Anh Luu TD, Li YP, Lim TB, Jiang J, Ackers-JohnsonM, S-Y Foo R, Engineered circular RNA sponges act as miRNA inhibitors to attenuate pressureoverload induced cardiac hypertrophy, Molecular Therapy (2020), doi: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2020.04.006.

转载请联系邮箱授权：[e-mail]

 近期热文 

“circRNA”微信公众平台由

『广州吉赛生物科技股份有限公司』运营，

旨在为circRNA研究同行

提供最新科研资讯和研究方法，

服务广大生命科学工作者和医学工作者。

如果您有好的文章或Idea，

千万别让它埋没，

欢迎大家分享或投稿。

小编在编辑微文时特别鸣谢，

另有惊喜送出！

投稿邮箱：[e-mail]

长按下方图片识别二维码，一起涨知识吧！

最新研究进展

分享科研干货

长按识别关注公众号

分享研究技巧

经验交流平台

长按识别进入群聊