转录组测序结合RBP预测分析circRNA生成机制和功能

2020年3月19日，丹麦奥胡斯大学的Trine Line Hauge Okholm和Jakob Skou Pedersen为共同通讯作者在预印本杂志BioRxiv发表了一篇题为“Transcriptome-wide profiles of circular RNA and RNA binding protein interactions reveal effects on circular RNA biogenesis and cancer pathway expression”的文章，报道基于全转录组测序结果分析circRNA与与RNA结合蛋白（RBP）的相互作用情况，预测分析了调控调控circRNA的生成的RBP机制及其在癌症发生发展中的作用（[1]）。

环状RNA(circRNA)是一种共价闭合的RNA分子，通常由pre-mRNA反向剪接衍生而来。RNA结合蛋白（RBP）是与双链或单链RNA结合的蛋白质。最近有研究表明RBP影响circRNA生命周期的全部过程，一些RBP还参与了circRNA的生成，如Quking(QKI)、FUS和HNRNPL等等。由于circRNA和RBP相互作用的例子少，对于这种互作的功能研究还不是很清楚。本篇文章阐述了circRNA与RBP相互作用的潜力以及RBP对circRNA功能的影响。

在HepG2和K562中，circRNA高表达且与RBP共定位

利用全转录组RNA-Seq数据集，在HepG2和K562中分别检测到26,174和24,076个特有的circRNA。选取前1%，划分了两个高表达的circRNA组。评估RBP在两组circRNA上结合的位置。结合位点大多数位于外显子，内含子位点通常被剪接剔除，而与剪接位点边缘结合的RBP可能参与pre-mRNA的剪接。RNA-Seq数据分析，免疫荧光成像对circRNA和RBP定位，结果表明94%的circRNA可以和RBP相互作用，并且共定位于亚细胞不同区室中。

KHSRP结合在circRNA侧翼的内含子上并影响其生成

为了全面分析RBP是否参与circRNA的形成，检测高表达circRNA、circRNA和线性外显子（非环状RNA上的外显子）上的RBP结合位点，发现KHSRP结合位点在circRNA的两侧内含子富集，且高表达circRNA组富集最多。KHSRP定位于细胞核，因此假设KHSRP在细胞核中结合circRNA侧翼的内含子，从而促进circRNA的生成。K562细胞中，敲低KHSRP会使circRNA表达下降，证实KHSRP参与circRNA的生成。

RBP结合位点在circRNA的外显子上富集

HepG2和K562细胞中，检测各区域RBP结合位点的丰度，circRNA上反向剪接的外显子（BSJ circ-exon）>circRNA上外显子（circ-exon）>线性外显子。表示来源于circRNA的外显子相比较于线性的外显子富集更多的RBP结合位点。总体而言，RBP结合位点在circRNA的外显子上富集，并且某些RBP优先结合circRNA。

circRNA与RBP的相互作用有细胞类型特异性

RBP结合位点的数量与构成circRNA外显子的数量没有显着关系。对于同一circRNA，在不同的细胞系之间，RBP结合位点的丰度也会不同。例如，HepG2和K562中circGSE1的表达水平相似，但是K562的circGSE1富集RBP结合位点，而HepG2中的circGSE1并不富集RBP结合位点。此外，不同细胞系之间，结合到同一circRNA的RBP也有所不同。在HepG2中，只有一个RBP GRWD1可以与circCDYL结合，而在K562中，存在九种不同的RBP与之结合。

在这两个细胞系中评估120个高表达的circRNA和34个RBP之间的相互作用，相同的circRNA-RBP互作不到15％。表明细胞类型特异性的circRNA-RBP互作是一种普遍现象。

HepG2中，circCDYL-RBP互作的调控机制

circRNA可以通过多种方式来调节RBP。例如，circRNA可以作为诱饵将RBP保留到特定的细胞间隔中、作为支架促进两个或多个RBP之间的接触，或者作为更大功能复合物中的一个单元。为了更深入了解circRNA对RBP的调控机制，选取circCDYL为对象做进一步研究。HepG2中使用siRNA敲低（knockdown，KD）circCDYL，QuantSeq测量mRNA的表达变化，KEGG通路分析表明，circCDYL KD激活了癌症通路，特别是MAPK信号通路。RIP实验证实circCDYL可以与IGF2BP1和GRWD1互作。

GRWD1是一种多功能蛋白，在癌细胞中过表达。GRWD1表达的升高负调控TP53，并促进肿瘤发生。因此，假设circCDYL充当GRWD1的海绵，调控GRWD1对靶基因的作用，包括TP53，从而抑制GRWD1的促癌作用。实验结果显示，circCDYL KD时大多数下调的基因在GRWD1 KD时上调，包括TP53，证实了circCDYL充当GRWD1海绵的假说。

IGF2BP1是一种转录后调节因子，通常被赋予致癌作用，可以与MAPK信号转导途径有关的基因相互作用并调节其表达。PLA2G2A是MAPK途径的一部分，在结直肠癌中上调，并且与不良的临床结果相关。PLA2G2A在IGF2BP1 KD时下调，而在circCDYL KD时，其丰度增加了19倍以上。表明circCDYL作为IGF2BP1海绵，抑制IGF2BP1对PLA2G2A的正调控，进而抑制MAPK通路，抑制癌症。这两个结果表明，circCDYL可以作为RBP的海绵来降低RBP对靶基因的调控。

在膀胱癌中，验证circCDYL可以作为RBP的海绵来抑制癌症

有报道显示circCDYL在非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）患者中高表达，并且与良好的预后呈正相关。为此，假设在膀胱癌（BC）中，circCDYL作为RBP海绵来抑制癌症。在BC的FL3细胞系中，使用RIP、pull down、WB和qRT-PCR 证实了circCDYL可以与IGF2BP1、 IGF2BP2和GRWD1互作，不同于HepG2，circCDYL-IGF2BP的互作最强。

IGF2BP1和IGF2BP2具有致癌作用，并正向调节各种癌基因的表达。UMCD3细胞中敲低circCDYL和RBP观察癌症特征。在circCDYL KD时，几种增殖途径上调，而免疫途径则下调。在IGF2BP1 KD时，增殖途径被下调，免疫途径被上调。证实circCDYL作为IGF2BP1的海绵，抑制IGF2BP1的致癌作用。最后，分析了一个本地患者队列（n = 56）中circCDYL的表达及其临床相关性。circCDYL的表达升高与良好的临床结果相关。以上得出结论，circCDYL与BC细胞中的致癌RBP IGF2BP1和IGF2BP2相互作用，来调控癌症。

参考文献

1. Trine Line Hauge Okholm，Shashank Sathe，Samuel S. Park，et al. Transcriptome-wide profiles of circular RNA and RNA binding protein interactions reveal effects on circular RNA biogenesis and cancer pathway expression.bioRxiv,2020,https://doi.org/10.1101/2020.03.19.997478.

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