昼夜节律与急性缺血性脑卒中相关性机制的研究进展
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基金项目
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•山西省医学重点科研项目（2021XM14）
•山西省重点研发计划项目（201903D321226）
全球疾病负担研究（GBD）数据显示，卒中是我国成人致死、致残的首位病因，其中，急性缺血性脑卒中（AIS）的发病率目前仍处于逐年上升的阶段。
因此，积极预防AIS的发生，改善AIS的发展及预后，具有广泛的前景。
相关研究提出，除了常见的高危因素外，生物钟基因及昼夜节律与AIS的发生、发展和防治也紧密相关。
AIS的发病时间具有昼夜节律的特点，高危时段为上午6：00—12：00，与其他时段比较，发病率增加了79%。
因此，生物钟可能参与AIS的病理生理过程，是卒中潜在的干预靶点。
现从直接影响与间接影响两方面深入探讨生物钟与AIS的关系。
一、生物钟基因与昼夜节律
哺乳动物的细胞自主分子钟是由2条紧密相连的转录/翻译反馈回路（TTFLs）产生的，它们共同作用产生稳固的24h基因表达节律。
其中，核心TTFL由4个完整的生物钟蛋白（CLOCK、BMAL1、PER和CRY）以及调节磷酸化的激酶（CKIα、CKIδ和CKIε）、磷酸酶（PP1、PP5）驱动，从而定位和稳定这些生物钟蛋白。
具体表现为生物钟核心基因Bmal1、Clock表达产生的蛋白构成Clock/Bmal1异二聚体，激活下游Per、Cry基因以及其他钟控基因的转录。
PER和CRY蛋白在细胞质中形成抑制性复合物，并转运到细胞核作用于Clock/Bmal1异质二聚体，抑制其进一步的转录激活。
当PER和CRY蛋白通过泛素化降解时，其复合物对Clock/Bmal1异质二聚体的抑制被解除，循环再次以约24h的周期开始。
其中，酪蛋白激酶CKIδ和CKIε通过控制PER-CRY复合物的降解以及影响其进入细胞核的速率，在生物钟的内在周期中发挥重要作用。酪蛋白激酶CKIδ和CKIε的活性分别受到PP1和PP5磷酸酶的抑制或调控。
另一条TTFL则是通过RORa、b、c的转录激活和REV-ERBα、β的抑制产生的。
TTFL驱动Bmal1转录的节律性变化，导致Cry1mRNA表达延迟，使其与受Clock/Bmal1异二聚体调节的基因相抵消。
虽然BMAL1峰值的节律性变化并不需要驱动核心TTFL，但ROR/REVTTFL诱导的Cry1表达延迟对适当的昼夜节律至关重要。
两条协同、紧密相连的反馈环路确保了机体抵抗外部环境干扰的稳固性，有助于保持精准的昼夜节律，也有助于在昼夜节律的转录输出过程中产生相位延迟，从而为局部生理机能提供最佳的基因表达时间。
近年来，人们对生物钟如何驱动24h计时来协调生理节律的认识不断加深，但仍然缺乏对昼夜节律分子基础以及组织依耐性生物钟调控的进一步探讨。
因此，需要更多的研究来解释24h昼夜节律是如何产生的，以及个体间差异是如何通过遗传突变和基因多态性影响这一节律的。此类研究也将有助于确定分子靶点和昼夜节律的药理调节机制。
二、昼夜节律对AIS的直接影响
昼夜节律可以通过调节激素水平、血管炎症、血管自身调节能力、内皮功能、血栓形成水平和内源性溶栓水平等直接导致AIS的发生。
1.昼夜节律与激素水平
人体的皮质醇分泌具有明显的昼夜节律，研究证实，皮质类固醇激素通过糖皮质激素提高血管对儿茶酚胺的敏感性，以及抑制前列腺素的合成，从而增强血管收缩，脑血管收缩增强与其他因素共同作用可促进AIS的发生。
因此，皮质醇与AIS的发生可能具有相关性。同时，皮质醇的分泌以清晨6：00—8：00左右最高，凌晨2：00—4：00左右最低，这与AIS发病高峰期相吻合，再次为两者之间的相关性提供了依据。
而皮质醇这种周期性的分泌是由生物钟控制的。
2.昼夜节律与血管炎症
IL是一类促进或抑制炎症过程的调节蛋白，在炎症反应中起着重要作用。相关研究发现，钟基因Bmal1可通过驱动Nr1d1（编码Rev-Erbα）基因的表达，从而抑制TNF-α及IL-6释放。
TNF-α可直接作用于血管内皮细胞，造成内皮损伤。更为重要的是，IL-6是AIS发生发展的独立危险因素，可促进细胞间黏附分子-1表达，而后者可参与调节白细胞迁移和黏附，是血栓形成和炎症反应等重要生理病理过程的分子基础。
另一方面，IL-6还可以上调血浆纤维蛋白原和激活血小板生成素的合成，促进局部血液凝固，减少组织灌注。
Chen和Yang的研究表明，血清IL-6基因多态性与缺血性卒中的个体易感性存在相关性。动脉粥样硬化是AIS和急性冠状动脉综合征（ACS）等血管事件发病的共同病理基础。
即使颅内动脉和其他相似尺寸动脉的解剖、代谢等特点有所不同，但作为全身动脉粥样硬化的一部分，颅内动脉粥样硬化也存在类似于冠状动脉和颅外颈动脉不稳定斑块的病理表现。
基质金属蛋白酶（MMPs）参与颅内外动脉粥样硬化斑块的形成和血管壁的重塑，MMPs浓度升高可能导致斑块破裂，引起AIS和ACS等。同时，MMPs活性的增强导致促炎因子IL-1β的激活。
一项针对ACS患者的研究发现，ACS患者中MMPs的表达水平较高，同时该类患者MMPmRNAs水平与生物钟基因mRNA水平呈负相关，这提示生物钟基因可通过调节MMPs的表达水平影响动脉粥样硬化斑块的稳定性。
目前有关生物钟基因基于MMPs与AIS相关性研究的报道较少，随着研究的不断深入，为两者之间的相关性探索提供了可能。
3.昼夜节律与内皮功能/血管自身调节节律
内皮功能的昼夜节律性在早期科学文献中都有一致的报道。研究发现在血管内皮细胞中存在时钟基因CLIF，也被称为BMAL2。
外周组织中的CLOCK和BMAL2都可能直接调节纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）基因的昼夜表达，从而促进晨起时血栓栓塞事件的发生。
Viswambharan等也报道了昼夜节律钟基因Per2在内皮介导的血管反应调控中的作用，小鼠中per2基因的缺失会损害内皮功能，减少一氧化氮和血管舒张性前列腺素的生成，以及增加环氧化酶-1（COX-1）衍生血管收缩剂的释放。
清晨脑血管对CO2反应性降低和脑血管的自我调节功能受损可能是该时段脑卒中风险增加的潜在原因。研究发现，与傍晚获得的测量结果相比，大脑的自我调节能力在清晨减弱。
血流介导的内皮依赖性血管舒张功能的降低可能是大脑中动脉血流速度（MCAv）对CO2反应性降低的部分原因。
这种大脑自我调节功能的损害体现在站立后MCAv和皮质氧合血红蛋白浓度降低。该现象与卒中高危人群紧密相关，如老年人或睡眠呼吸障碍患者。
4.昼夜节律与血栓形成水平/内源性溶栓水平
血栓形成包括血管内皮损伤、血流状态改变、血液高凝状态三大要素。其中，血小板功能及凝血因子浓度的改变均可影响血液凝固性，进一步影响血栓形成。
血小板生物学显示出显著的昼夜变化。巨核细胞的形成，以及巨核细胞表面时钟蛋白mPer2和mBmal1的表达呈现出昼夜节律性。既往研究指出，内源性昼夜节律系统对人类血小板活化具有显著的影响。
3种血小板活化标志物（血小板表面GPⅡb-Ⅲa、血小板表面P-选择素和血小板表面GPⅠb）在上午8：00—9：00的内源性昼夜节律阶段达到峰值，这与主要不良脑血管事件的高危时间（上午6：00—12：00）一致。
全身凝血筛查检测凝血酶原时间（PT）在早晨出现最低值，上午8：00到下午4：00PT和活化部分凝血酶原时间（APTT）的差异程度为10%，而APTT最长在上午8：00，最短在下午2：00。
动物实验发现，FⅦ水平在小鼠模型中显示出明显的24 h变化规律，在由亮到暗过渡时达到峰值，考虑到小鼠的夜间活动习惯，小鼠在黑暗期开始时的FⅦ峰值则与人类在光照期开始时的FⅦ峰值相对应。
此外，Iversen等观察到FⅧ活性（FⅧ：C）有明显的昼夜变化，在上午8：00左右达到峰值，然而，由于FⅧ在循环中与血管性血友病因子（VWF）结合，他们还假设FⅧ：C的节律性变化可能在一定程度上受到其载体蛋白VWF的影响，而关于VWF昼夜变化的报道仍存在争议，有待进一步研究。
凝血级联的激活主要由组织纤溶酶原激活物（t-PA）及其有效抑制剂组织纤溶酶原激活因子抑制剂1（PAI-1）之间的相互作用决定，传统上伴随着纤溶活性的增加，可减弱凝血过程，防止血管阻塞。
有研究观察到纤维蛋白溶解系统各参数同样具有昼夜变化，其中，PAI-1受内源性昼夜节律控制，在清晨达到峰值，并受到时钟基因Bmal1的调节。
研究发现，Bmal1缺乏会扰乱肝脏和血浆中PAI-1的昼夜节律。相反，t-PA活性在清晨显著降低，下午2：00开始增高。
三、昼夜节律对AIS的间接影响
昼夜节律紊乱与AIS的高危因素有显著的相关性，可间接造成AIS。
1.昼夜节律基于血压调控对AIS的影响
高血压是卒中的决定性危险因素，生物钟可通过影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS系统）、血管功能、肾脏离子代谢等的昼夜节律影响高血压的形成。
有实验观察到Cry-/-（Cry基因被彻底敲除）的高血压小鼠RAAS系统激素分泌的昼夜节律与对照组相反，且循环中24h激素含量显著升高，提示CRY蛋白可能通过RAAS系统调节血压的昼夜节律。
另有研究发现，Bmal1-/-小鼠血管内皮细胞中NADPH氧化酶表达增加，一氧化氮轴解耦连使超氧化物浓度升高，导致血管内皮功能障碍，从而导致持续低血压状态。
与之相反，Per-/-小鼠血中前列腺素与血栓素A2浓度升高，血管收缩功能明显增强。Solocinski等发现PER1蛋白能够通过正性调控肾小管的Na+-H+交换器、Na+转运蛋白和钠通道的表达来调节肾脏对Na+的代谢。
除此之外，生物钟基因Clock、Reverbα、Revervb、Dbp亦参与血压的调节，或成为高血压易感基因，基因表达水平的检测有助于更加精准地预防和治疗高血压。
2.昼夜节律基于血糖调节对AIS的影响
血糖异常与AIS密切相关，中枢及外周生物钟协同作用对血糖进行调控。下丘脑视交叉上核（SCN）的中央时钟不仅与外周时钟同步，而且影响糖代谢各个环节的昼夜节律，包括睡眠-觉醒行为、食物摄入、激素分泌、胰岛素敏感性等。
SCN通过连接下丘脑区域（如室旁下区、腹外侧视前区和下丘脑背内侧）控制睡眠-觉醒周期，并通过增强对睡眠-觉醒行为昼夜节律的调节来控制食物摄入。
此外，研究发现，在啮齿类动物SCN发生病变后的8周内将出现胰岛素抵抗，提示全身胰岛素敏感性的昼夜节律是受SCN控制的。在针对人类的研究中，同样也观察到了SCN在控制胰岛素敏感性方面的作用。
在外周组织中，肝脏、小肠、肌肉、脂肪等在维持血糖稳定中扮演着重要角色。
其中，小鼠肝特异性BMAL1缺陷可使葡萄糖转运蛋白-2（Glut2）的表达以及空腹血糖的昼夜节律性受损，CLOCK通过调控Gys2（肝糖原合成的限速酶）的转录激活调节肝糖原合成的昼夜节律，肝脏中CRY1上两个不同的LC3相互作用区（LIRs）可通过调节CRY1的自噬降解来发挥调控血糖昼夜节律的作用，揭示了LIRs是血糖调节的潜在靶点。
此外，BMAL1通过调节膜糖转运体的表达，从而使小肠最大单糖摄取的时间与习惯摄食期相匹配；CLOCK和BMAL1通过改变蛋白质水平和葡萄糖转运蛋白-4（Glut4）的膜转位来调节肌肉组织的胰岛素敏感性，以及通过表达去乙酰化酶SIRT1来调节胰岛素信号通路；啮齿类动物的数据表明，视黄醇结合蛋白受体STRA6可能参与脂肪组织胰岛素敏感性昼夜节律的调节。
因此，昼夜节律紊乱可通过各个环节及组织影响血糖的调节，从而影响AIS的发生。
3.昼夜节律基于血脂代谢对AIS的影响
血脂异常是AIS的独立危险因素，生物钟基因在整个机体的脂质代谢中起着重要作用。
既往研究表明Bmal1全基因敲除可诱导小鼠高脂血症并增强其动脉粥样硬化。
而最新研究发现，肠道特异性Bmal1基因缺失可预防小鼠高脂肪喂养引起的肥胖、高脂血症和脂肪肝，肠道生物钟基因为脂肪吸收的加速器，其机制为BMAL1通过直接结合启动子中的E-box，反式激活Dgat2基因（编码三酰基甘油合成酶Dgat2），从而促进膳食脂肪吸收。
此外，CLOCK和BMAL1调节脂解过程中关键酶的表达，如脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）、脂蛋白脂肪酶（LPL）和激素敏感脂肪酶（HSL）；胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）是催化内源性胆固醇生物合成胆汁酸的限速酶。
研究发现，Rev-erbα可通过抑制Lrh-1受体来调节CYP7A1，使CYP7A1呈现出明显的昼夜节律性。由此可见，控制生物钟基因表达可能会为血脂异常及其相关疾病带来新的切入点。
四、总结与展望
昼夜节律可直接或间接影响AIS的发生、发展及预后。目前，关于昼夜节律与AIS的相关性研究备受研究者们关注，但其机制尚未完全明了。目前相关研究主要集中于动物实验，临床研究较少。
因此，需要针对人类自身进行更多的研究，以阐明生物钟基因对AIS的影响。此外，随着研究的不断进展，未来有望发现新的以分子时钟为目标的昼夜节律分子，这使得对AIS患者生物钟疗法的研究成为具有潜力的研究方向。
作者姓名、单位
来源：神经疾病与精神卫生 2022年10月20日第22卷第10期
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