昨天 Science 以封面形式刊发了美国索尔克生物研究所（SalkInstitute for Biological Studies）副教授 Clodagh C. O’Shea 课题组的研究论文，她们利用一种称为 ChromEMT 的断层扫描电镜技术，在原位观察了染色质的 3D 结构和压缩情况，这是世界上首次在原位（in situ）对染色质3D结构的观察。
染色质并不想我们设想的那样折叠：(1) 此前认为染色质的直径为 30~120nm，而本文通过更高分辨率的图像揭示，染色质的直径为 8~24nm；(2) 细胞间期的染色质分布散乱（生命本无序）；(3) 染色质的初级结构在有丝分裂过程中并没有改变，可以揭示基因书签现象（详见此前的科普文）；(4) 5~24nm 染色质可以灵活地弯曲、折叠和组装成各种尺寸和密度的纤维。染色质结构复杂多变解释了不同细胞的独特命运。毫无疑问，教科书将再次被改写。
两米的DNA如何折叠到微米级的细胞核中
——从经典的染色质结构说起
1665 年，英国皇家学会出版了科学家罗伯特·虎克（Robert Hooke）的《显微图集》一书，这本风靡一时的书中共包含 58 幅虎克用自制显微镜看到并亲手绘制的图片，其中有一幅植物软木薄片的图片。虎克观察到这些植物组织中各个微小的单元像教士们住的单人房间一样，因此用单人房间 Cell 来命名（Cell 这一概念也被沿用至今），这是人类历史上第一次观察到细胞。人的体细胞直径只有几微米，即使是最大的卵细胞，也不过 100~140 微米。而人的体细胞DNA总长约为 2 米，把 2 米长的 DNA 压缩到微米级的细胞核中，细胞是如何完成这一看似不可能的任务的呢？
图 1. 左，罗伯特·虎克画像；中，虎克制作并使用过的显微镜，目前珍藏在华盛顿国家健康与医学博物馆；右，植物组织及细胞的手绘图。
1953 年，詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克等首次揭示了 DNA 的双螺旋结构，为 DNA 如何存储和复制遗传信息提供了结构基础。然而，DNA 双螺旋只是获取了 DNA 二级结构信息。（一级结构指的是 DNA/RNA/蛋白质等生物大分子中的脱氧核糖核苷酸/核糖核苷酸/氨基酸等的序列排布信息；二级结构指的是 DNA/RNA/蛋白质在局部是如何连接和折叠的，比如核酸中碱基通过氢键连接；三级结构指的是 DNA/RNA/蛋白质等在空间上是如何缠绕和组装的）。
在细胞核中，DNA 是如何组装到染色质中的呢？目前比较清楚的是，147bp 的 DNA 缠绕在组蛋白八聚体（H2A、H2B、H3、H4各两个）周围，形成约 11nm 的核小体颗粒。而核小体与核小体之间通过 20~75bp 的 DNA 连接，组蛋白 H1 可以结合到这些连接DNA（linkerDNA）上。这也就是经典的“绳珠模型（Beads on a string）”。但只有以上的组装还远远不够。目前有很多方法来探索 DNA 的组装和染色质的 3D 结构，并且逐渐积累成了如下的结构示意图，这也是绝大多数教科书中会提到的结构。
图 3. 所谓经典的 DNA 组装和染色质 3D 结构的组装示意图
如图中所示，2.5nm 的 DNA 螺旋与缠绕在组蛋白八聚体上，形成约 11nm 的核小体上，而 DNA-核小体多聚体进一步折叠，形成约 30nm 的纤维。目前通过电子显微镜和 X 射线晶体衍射技术，对这种 30nm 的纤维进行研究，发现存在两种不同的模型，即螺线管纤维模型（solenoid fiber models）和Z字形纤维模型（zigzagfiber models）。
图 4. 螺线管纤维模型和 Z 字形纤维模型，图片来自于：http://slideplayer.com/slide/3383205/
如上图，在螺线管纤维结构中，沿着纤维的轴，每 11nm 有 6 个核小体，形成直径为 33nm 的纤维状结构；而 Z 字形纤维模型中，每 11nm 有 5~6 个核小体，形成约 27.2~29.9nm 的纤维状结构。如图 3 显示，约 30nm 的纤维进一步组装成约 120nm 的染色丝，300~700nm 的染色单体，进一步组装为有丝分裂的染色体。
但是（“但是”最终还是来了），这种折叠模型是基于体外形成的染色质的结构而绘制的。此前通常的做法是，体外重组纯化好 DNA 和组蛋白，或者在透性化细胞（在不造成细胞裂解以及不破坏细胞内部有机结构的情况下,改变细胞壁和细胞膜的通透性,使得小分子和一些较大分子物质能够自由进出的细胞，这已经不是细胞的自然状态，会影响染色质的结构）中鉴定。
此外，近些年来冷冻电镜和X射线散射、电子能谱成像（ESI）等技术的不断发展，以及超分辨率光学显微镜和荧光标签应用于超高分辨率成像，为解析染色质 3D 结构提供一丝希望。但是它们都有各自的局限，比如荧光标签中，重金属氧化物四氧化锇 OsO4 可以结合 DNA，但是需要酸处理，这种处理可能会破坏染色质自然状态下的结构。因此截至到目前，人们都没有搞清楚，在自然状态的细胞中，那些染色质多聚体结构和 3D 结构是如何进行组织的以及它们在细胞分裂间期和有丝分裂期的真实状态。
ChromEM：突破限制，成功观测染色质DNA
荧光团在被激发后，不仅仅会释放光子，重新回到基态，并且可以进行系间窜跃（intersystem crossing, 处于激发态的原子或分子其自旋多重态非辐射失活地发生变化的现象），在系间窜跃过程中，会释放活性氧，可以氧化荧光分子表面的二氨基联苯胺（DAB），进而形成多聚体，进一步可以通过电子显微镜进行观测。
图 5. 荧光团的系间窜跃的原理图
作者先用一个小的绿色荧光蛋白 miniSOG（单重态氧发生器）进行检验。MiniSOG 可以对 DAB 进行光氧化，因此可作为遗传标签对蛋白进行可视化。那么，可以对 DAB 进行光氧化的DNA结合荧光染料是否可以用来观测细胞核中 DNA 和染色质呢？为了鉴定这种探针，作者开发了一种基于细胞的实验，筛选DNA荧光染料对 DAB 进行光氧化的活性。
图 6. 筛选 DNA 荧光染料对 DAB 进行光氧化的活性
此前文献报道，低于 400nm 波长的光会诱导 DAB 的自动多聚化，导致棕色的沉淀（DAB多聚体形成的证据）和非特异性的染色，因此本文选择更长的波长。本文利用人骨肉瘤 U2OS 细胞系，用戊二醛固定，用 DNA 荧光染料染色，随后在 DAB 存在的情况下进行激发。如果发生了DAB的光氧化，那么在细胞核中会出现黑色沉淀。团队做了很多筛选，最终发现只有 DRAQ5（一种深红荧光，膜通透的蒽醌染料，激发波长为 646nm，最大发射波长为 697nm）的激发可以对 DAB 进行光氧化。
图 7. DRAQ5 介导的 DAB 光氧化可以用来检测染色质
每个组蛋白八聚体外缠绕的 147bp 的双链 DNA 可以为 DRAQ5 提供最多 14 个小沟（DNA 双螺旋结构中存在大沟和小沟）结合位点。此外，无论细胞是在固定前，还是在固定后，DRAQ5 对 DNA 的染色都可以催化染色体表面的 DAB 的多聚化。在活细胞中，DRAQ5 的染色会让 RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物和组蛋白 H1 从 DNA 上剥离，因此本文选择先固定细胞，然后染色。需要特别注意的是，本文提到一直是对染色质3D结构的原位（in situ）观测，而并不是活细胞。一方面是活细胞的染色质是不断动态变化的，让问题变得更加复杂；另一方面，戊二醛的固定作用并不影响染色质的超结构，而且对DAB沉淀的扩散作用影响最小。
前文中提到过四氧化锇 OsO4，在电子显微镜中，它通常被用作固定细胞和对细胞膜染色。但是，OsO4也可以结合DAB多聚体。因此，如果 OsO4 可以对 DRAQ5 标记的 DNA 表面的 DAB 进行染色，那么用电子显微镜就可以对染色质进行观测。
图 8. ChromEM 操作流程
首先，固定 U2OS 细胞，然后用 DRAQ5 进行便签，在 DAB 存在的情况下激发。透射光图像显示黑色的 DAB 沉淀只出现在细胞核中的激发范围内（图 8 中蓝色的虚线框）。随后，整皿细胞用 OsO4 染，随后制作成约 70~80nm 的薄片，用透射电镜（TEM）进行分析。在没有光氧化的细胞中，OsO4 浸染细胞核膜和核仁，但是对染色质没有作用。而在存在 DAB 光氧化的细胞中，DNA 和染色质都被 OsO4 染上，并且在电镜中可以观测到。
图 9. ChromEM 的效果图
ChromEM结合EMT：破译原位染色质超结构密码
前面我们观察到的只是二维的图片，那么如何解析染色质的 3D 超结构呢？这就需要用到 EMT。何为 EMT，即断层扫描电镜（electronmicroscopy tomography）。
图 10：ChromEMT 的原理图
类似于此前步骤，这次利用人的小气道上皮细胞（SAECs），用 DRAQ5 进行标签化，与 DAB 孵育，对 DRAQ5 进行激发，从而催化DAB的氧化；另外设置没有激发的对照组。随后细胞用 OsO4 浸染，然后从一个倾斜角度和八个倾斜角度用 EMT 进行观测，最后用 TxBR 软件包进行建模。
EMT 的数据总共包含 141 个约 1.64nm 厚的断层切片（TS），从 0 开始编号，即 TS#0 到 TS#140。其中单倾斜角度的有 121 张图片，八倾斜角度的有 968 张图片。
图 11：单倾斜角度和八倾斜角度的 ChromEMT 结果
由于 OsO4 可以与核膜中的脂类反应，因此可以提供非常有价值的标准化参考。
染色质结构真相：直径为 8~24nm 的杂乱无章的链
通过前面的 ChromEMT，作者获得了大量的图像数据，随后对图像进行分析和建模。
图 12：图像分析过程
结论一：染色质的直径并没有此前鉴定的那么宽
在图 3 所示的染色质经典的折叠模型中，30~120nm 的纤维是染色质的主要结构，但是ChromEMT 的结果显示（图 12 右下角），染色质直径在 8~24nm 之间，并没有此前鉴定的那么长。作者进行了额外的说明，鉴于她们只对染色质中小的区域进行了分析，而细胞核中不同区域的染色质密度以及染液浓度可能不同。那么问题来了，在细胞间期核中染色质的三维的密度如何？更高的染色质包装密度是否与染色质组装成 30~120nm 的纤维有关。通过下文的分析，结果证实了与染色质直径与其空间分布密度并不相关。
图 11：体外实验结果（左图）以及更高分辨率的结果（右图）
那为什么此前会观察到 30~120nm 的染色质呢？作者重复了别人的体外实验，然后用ChromEMT 进行观测，同样发现了 100~200nm 的染色质簇，但是更高分辨率的照片显示，这些染色质簇其实是由多个染色质纤维聚集起来的。
结论二：细胞间期的染色质分布散乱
为了测定细胞核中染色质的三维空间浓度，作者对整个 EMT 核体积进行了 8×8 的划分，使得每个体积中包含 64 张小的断层扫描照片。每个小的正方体的边长为 120nm，这么大的空间足以用来捕获高维的 30~120nm 的染色质纤维。细胞核中染色质的三维空间浓度以热图显示（上图右边），在处于细胞间期的细胞的核中，不同区域染色质的密度不同，在整个空间零散分布。
图 15. 细胞间期和细胞分裂期染色质的 3D 结构
结论三：染色质的初级结构在有丝分裂过程中并没有改变
除了细胞分裂间期，作者还研究了有丝分裂过程。染色质的初级结构在有丝分裂过程中并没有改变，这有助于揭示解释染色质压缩过程的快速动态调控，以及如何通过细胞分裂将表观遗传的相互作用和结构传递给子细胞。
结论四：5~24nm 染色质可以灵活地弯曲、折叠和组装成各种尺寸和密度
与感性的纤维不同，本文揭示的 5~24nm 直径的染色质，它们非常灵活，可以弯曲和拉升到不同的长度，也可在不同的密度和水平进行压缩和组装。
结论五：染色质结构复杂多变解释了细胞的命运
染色质结构的多样性为 DNA 序列、相互作用、连接 DNA （Linker DNA）的长度、组蛋白变体、修饰等的不同组合整合起来精细化调控基因组 DNA 的功能提供了结构基础。
具有诗意的索尔克研究所&集美貌与才华于一身的 Clodagh C. O’Shea
本文通讯作者为美国索尔克生物研究所（Salk Institute for BiologicalStudies）的 Clodagh C. O’Shea。
图 16. 索尔克生物研究所的标志性景观（来源于 Google 图片）
美国索尔克生物研究所是坐落在美国加州南部圣地亚哥拉霍亚的一个独立研究机构，1960 年由乔纳斯·索尔克（防治小儿麻痹症疫苗的发明者）创立，此外还有雅各布·布罗诺斯基和弗朗西斯·克里克；1962 年正式投入运行。这所研究所是美国生命科学领域成果最多、质量最高的研究机构之一。2004 年，时代高等教育增刊将索尔克研究所列为世界第一的生物医学研究机构。2009 年，科学观察将其列为神经科学和行为学领域全球第一的研究所。
图 17. 索尔克生物研究所一隅（来自于 treemode.com）
美国索尔克生物研究所由国际知名的建筑大师路易斯·康设计。路易斯·康被誉为建筑界的诗哲，索尔克生物研究所是建筑师路易·康走向巅峰的代表作品。建筑座落在圣地亚哥市一块能够俯瞰太平洋的用地上。这栋建筑的主体部分具有明确的轴线构图；空间组合上重现历史上已有的空间等级序列；在建筑形体、大小、开阖明暗等方面展现了许多古典传统的特征；最为重要的是，康在这里成功实现了古典的复兴并与现代建筑主流的融合。
图 18. 实验室一瞥（来自于 treemode.com，并不一定是 ClodaghC. O’Shea 的实验室）
4 英尺长的荧光照明器具与顶棚上的条状窄缝相互垂直。对应于底下混乱的实验室，它们为顶棚增添了视觉上的秩序，为整个实验室带来了康所期望的节奏感。
“自然不能创造艺术，做不出人所创造的事物，人以自然作为创造事物的手段，并把自然法则一一分开，但自然从不如此行事，它在种种和谐的条件下工作，我们称之为秩序。”
——路易斯·康
图 19. 研究所地面上的格言（来自于 treemode.com）
“Hope lies in dreams, in imagination and in the courage of those who dare to make dreams into reality.”
——Jonas Salk
图 20. 本文通讯作者 Clodagh C. O’Shea（有没有非常像好莱坞明星！！！）
Clodagh C. O’Shea 现在是索尔克生物研究所的副教授，霍华德休斯医学研究所的师资学者（Faculty Scholar）。
Clodagh C. O’Shea 本科毕业于爱尔兰的科克大学，随后在爱尔兰癌症研究基金会和伦敦帝国学院念博士，获得免疫学博士学位。在博士期间，她揭示了调控人类免疫系统发育的关键信号通路。随后她入选雷励国际远征（Raleigh International expedition）计划，去纳米比亚参加环境保护和发展相关的项目。之后她在加州大学旧金山分校的 Frank McCormick 的实验室从事博士后研究。Clodagh C. O’Shea 还是一名狂热的户外爱好者，喜欢探索世界上最冒险，最有异国情调的目的地，这可能就是她选择索尔克研究所的原因之一吧。
图 21. Clodagh C. O’Shea 和本文一作 Horng Ou 的合影
图 22. Clodagh C. O’Shea 实验室全家福
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Clodagh C. O’Shea 实验室的介绍视频，inspiring!!!
解密本期 Science 封面制作过程
在文章中，作者用了一种叫做 DRAQ5 的染料，一旦其被光激发后，可以催化 DAB 形成像金属粉尘一样的沉淀物，覆盖在染色质表面，而正是这一概念启发了艺术家对本期封面的创作。
图 23. 高级科学插画师 Valerie Altounian 正在绘制本期 Science 封面
为了模仿本文的方法学，Science 杂志的高级科学插画师 Valerie Altounian 希望在白纸上将“隐藏的”染色质的结构揭示出来，这就需要用到一种像粉尘一样的粉末。Altounian 走访了当地的艺术材料供应商店，她选择了一些真正的金属粉末，这些金属颜料可以与水或者胶水组合使用。
图 24. 调到合适的光强，以得到最好的显示效果
首先，Altounian 与设计总监 BethRakouskas 合作，确定染色质和封面标题的位置和排版。随后，Altounian 去她们的影像工作室，将金属粉尘敲打到一打纸的表面，接着进行制定好的设计创作。当完成之后，Altounian 用光做试验，以最好地展现金属粉尘的反射效果，并拍下照片。最后将图片进行数字化处理，用 Adobe Photoshop 来添加染色质的白色，沿着边缘对灰尘进行微调。就这样才大功告成！
-- The End --