Nature Methods：一个多功能的AAV-CRISPR-Cas9基因编辑系统横空出世
9月5日， NatureMethods在线发表了来自哈佛大学和Amy Wagers课题组关于AAV-CRISPR-Cas9系统的最新研究成果。
在这项研究中，George和Wagers团队对AAV-CRISPR-Cas9系统进行了动物体内传递效率检测、切割和激活效率检测。同时分别针对CRISPR-Cas9和AAV进行宿主免疫反应检测，最终证明该系统的可行性和优越性，为人类疾病基因治疗提供了一种更加安全可靠的方法。
文章通讯作者之一GeorgeChurch是现代遗传学研究领域的领军人物，同时他也是基因组测序、合成生物学领域的变革者。自CRISPR-Cas9作为新的基因编辑技术问世以来，George church便始终关注这一领域，并致力于不断丰富和完善这一技术。
George.M.Church
众所周知，CRISPR-Cas9基因编辑系统可实现精准的基因修饰及表观遗传学调控，为个体精准治疗带来了极大的希望，但其应用于临床仍面临着作用效率和安全等问题。传统的方法是利用DNA电穿孔以及腺病毒感染来进行体内基因编辑，但这会导致严重的炎症和免疫反应。
虽然通过免疫抑制可以减轻这些有害影响，但仍不可避免地伴随其它一些副作用。因此，当务之急是尽快找到一种能高效传递CRISPR-cas9，同时将引发的免疫反应降低至安全范围内的传递方法。
腺相关病毒（AAV）作为一种人细小单链DNA病毒，因其与人类血清的相容性及无致病原性，而受到科学家们的青睐，被用于基因治疗的研究。不同血清型的腺相关病毒，有组织优先性选择的特点，更有利于特定遗传疾病的治疗。
目前，在小鼠中已突出显示了腺相关病毒在杜氏肌营养不良、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症等遗传疾病中的治疗前景。未来基于腺相关病毒的CRISPR-Cas9应用应致力于生物防治及一些基于表观遗传的改变而不能治疗的疾病。
根据文章报道，GeorgeChurch和Amy Wagers巧妙地将CRISPR-Cas9分解为两个独立表达的蛋白，在共同感染组织或细胞后，这两个蛋白能通过各自携带的内含肽（intein）在体内实现组装，从而形成有活性的Cas9完整蛋白，这解决了AAV包装外源DNA片段容量小的问题。
此外，作者通过检测AAV-CRISPR-Cas9在体内多种组织和器官的基因编辑效率，证实其在不同器官和细胞中均能发挥作用，并且在肝脏中效率最高可达到10.9%，这与细胞转染及肌纤维细胞电穿孔效率相差无几，说明该系统可应用于在体基因编辑。
生物安全性一直是基因治疗重要的考虑因素，George等人同时检测了利用AAV-CRISPR-Cas9感染小鼠后的宿主免疫反应。结果显示相对于肌肉电穿孔Cas9质粒的方法，使用该系统感染的小鼠未出现显著的免疫反应（如导致CD45+细胞浸润，白介素2、IgM和IgG水平升高等），同时也没有观察到出现明显的肌纤维损伤及修复现象。
“从实验结果来看，证明这套系统具有很高的可行性。它不但弥补了AAV包装容量小的缺陷，同时也保证了可以较高的切割效率，更重要的是在生物安全性方面它有令人可以接受的结果。这为基因治疗提供了一种新的方法。”George Church在文中提到。
但该系统并非是毫无问题吗？显然不是。George Church同时也指出一些不足和有待完善的地方，例如报道中提及针对Mstn进行基因编辑时，在肝脏中脱靶效率仍接近4%，且on-target与off-target效率会随着AAV9-Cas9-gRNA的浓度增加而升高。
另外，在检测宿主免疫反应时，由于缺乏灵敏的检测方法，因此很难检测到肌肉细胞损伤及修复情况，故不能排除使用AAV-CRISPR-Cas9系统会导致出现组织特异性的免疫细胞毒性的情况。而这些问题也亟待后续研究来解决。
参考文献：
Wei Leong Chew, Mohammadsharif Tabebordbar, Jason K W Cheng, PrashantMali, Elizabeth Y Wu, Alex H M Ng, KexianZhu, Amy J Wagers & George M Church. A multifunctional AAV–CRISPR–Cas9 andits host response. Nature Methods (2016) doi:10.1038/nmeth.3993.
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