2016年度汇总：基因编辑CRISPR应用重大进展
基因编辑的明星路
首先，我们来看看基因编辑的发展历程，看过后，你一定想了解一下它究竟是什么，为何有如此殊荣。
基因编辑是什么？
基因编辑（gene-editing）的基本原理其实就类似word程序中的查找、替换或者删减过程，即人为地修饰宿主细胞DNA序列后，实现对特定的目的基因片段的“编辑”。
现今，基因编辑已经发展到第三代，包括第一代ZFN（1996年），第二代TALEN（2011年）及第三代CRISPR/Cas9（2013年），它们就像是GPS导航和剪刀的组合，GPS引导剪刀到特定基因位点进行靶向切割。（关于这三代的基本原理及简单介绍可点击查看）
科学家们利用基因编辑技术在基础医学研究中构建疾病动物模型，在临床治疗中攻克各种以前难以解决的疑难杂症，在农业发展中加速动物和植物的遗传育种。
特别是2013年CRISPR/Cas9出现后，低成本和操作的简单性为基因治疗打开了一扇大门。从小鼠到人类胚胎，科学家们已经进行了广泛的临床试验[1]。
CRISPR/Cas9结构图
基因编辑应用
①基因治疗：癌症，遗传病及传染病等；
②药物靶点筛选；
③动植物遗传育种等。
今天我们就一起来看看，在2016年，基因编辑有哪些突破进展值得我们关注的呢？
定义：即利用基因编辑技术在基因组水平上实现精准的分子修饰，从而达到治疗各类疾病的目的。
发展趋势：首先不得不说的是基因编辑技术对于疾病治疗的进展。如下图，对于基因治疗的研究，在最近几年特别是2013年CRISPR技术出现后，急速上升[2]。
此类疾病主要包括癌症（如白血病、肺癌等），罕见遗传性疾病（血友病、杜氏肌肉萎缩症、地中海贫血症等）及感染性疾病（艾滋病、乙肝）等。下图为2016年基因编辑药物在各类疾病的数量统计，可以看到癌症首屈一指，接下来是罕见遗传病、感染性疾病及血液病等[2]。
1.1 癌症治疗
基因编辑技术应用于癌症治疗，主要是指肿瘤免疫疗法。利用基因编辑（主要是CRISPR/Cas9）方法修饰T细胞，进而调动患者的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤能力，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
近几年来已经在多种癌症如白血病取得很好效果[3-5]。2013年肿瘤免疫疗法获十大科学突破榜首，伴随着CRISPR的出现，强强联合，使肿瘤免疫疗法突破了更多瓶颈[6]。主要包括CAR-T（嵌合抗原受体T细胞疗法）和TCR-T（T细胞受体TCR嵌合型T细胞）[7]。CAR-T在最近几年发展迅速，下面主要介绍CAR-T。
嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）：属于个性化治疗方法，采用患者自身T细胞通过基因工程修饰，经过嵌合蛋白修饰的T细胞识别并攻击带有特定抗原的肿瘤细胞，体外扩增后输至病人体内，引发免疫反应从而达到抗肿瘤效果。如下图所示。
CAR-T基本原理图
T细胞在抗肿瘤免疫过程中作为核心的执行者，众多的共刺激信号和共抑制信号调节T细胞反应的强度和质量，这些抑制信号即为免疫检查点。针对免疫检查点的阻断是增强T细胞激活的有效策略之一，也是近些年抗肿瘤药物开发最热门靶点[8]。
目前免疫检查点热门靶点，如下图：
一方面，当用慢病毒介导的转基因技术制备出CAR-T或者TCR-T细胞，再用CRISPR基因编辑技术敲掉两者中的某些基因，比如图中所示的潜在的免疫检查点，这样就可以大大增加CAR-T和TCR-T的效果和安全性。
另一方面，目前大多数CAR-T治疗使用的是患者自身的T细胞，涉及到新患者的T细胞分离，修饰和扩增，使得CAR-T治疗变得十分昂贵和耗时，严重制约了CAR-T治疗的发展。在这种情况下，CAR-T治疗比起基于抗体的检查点的癌症免疫抗体疗法（例如ipilimumab，pembrolizumab和nivolumab）更加昂贵。
但是我们如果可以产生通用的供体CAR-T细胞，CAR-T治疗将变得更快更便宜，因为“off-the-shelf”将大大增加CAR-T治疗的使用患者数量，缩短制备时间，且能够批量工业化生产。
然而，CAR-T细胞引起的移植物抗宿主病（GVHD）和被治疗者的排斥反应仍然是最大的障碍。在CRISPR/Cas9技术出现之前，ZFN和TALEN已经用于敲除T细胞中的内源性T细胞受体基因，通过这种方法来消除CAR-T细胞与被治疗者之间的排斥反应。
而CRISPR/Cas9系统的出现，将为“通用型CAR-T治疗”的发展提供更强大的火力，通过敲除T细胞上组织相容性抗原的表达来预防被治疗者免疫系统对CAR-T细胞的排斥。
CAR-T之临床试验逐年上升：美国领跑，中国后发制人
2010年以前，全球注册的CAR-T临床实验都集中在美国；
2013年起，中国301医院开始注册CAR-T的临床，且呈逐年递增趋势；
2015年，中国注册的CAR-T临床数目已经基本与美国持平，占当年全球新注册CAR-T临床总数的50%；
2016年中国已经超过美国[9]。
重大进展
2016年6月：NIH批准美国Juno首个CRISPR应用于人体的临床试验
从癌症患者体内提取出免疫系统的T细胞，利用CRISPR对T细胞进行基因修饰，并将基因修饰后的T细胞输回病人体内，这样它们将靶向摧毁肿瘤细胞[10]。
2016年10月：中国科学家开展全球首个CRISPR应用人体临床试验
8月，中国开始启动首个利用CRISPR编辑临床试验，治疗化疗、放疗以及其它疗法治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者；
10月，首名患者接受了经CRISPR技术改造的T细胞（敲除PD-1基因）治疗并表示治疗进展得很顺利，患者即将接受第二次注射[11]。
1.2 遗传病治疗
罕见病是指发病率极低，大部分属于基因突变导致的遗传病，且大部分没有有效药物治疗。近几年，随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术的发展，利用基因编辑技术修复突变基因，使治愈由基因突变引起的罕见病成为可能，如β-地中海贫血、肌肉萎缩症等。
镰状细胞病（SCD）和β地中海贫血症
定义：由于编码-珠蛋白的血红蛋白β基因（HBB）的突变造成的基因疾病，细胞成镰刀状（如下图）。目前针对这类疾病的治疗主要采用定期输血和干细胞移植法，昂贵且存在很大风险。
进展：2016年8月：科学家们通过CRISPR基因编辑技术，对分离自患者的人血祖细胞（Human bloodprogenitors）中编码胎儿血红蛋白的HBG1和HBG2基因启动子位置进行突变使其过表达胎儿血红蛋白，并具有运输氧气的完整功能[12]。
10月：科学家研究发现用CRISPR/Cas9对患者造血干细胞进行基因组编辑，校正后的患者干细胞可以产生正常的血红蛋白，进而将细胞注射到小鼠体内，使其产生健康的血细胞[13]。
10月：美国科学家们利用CRISPR基因编辑技术，在人体干细胞中修复了造成镰状细胞贫血病的基因[14]。
B型血友病
凝血因子IX（FIX）的基因存在缺陷，从而导致出血不止以及因出血而导致的遗传疾病。
进展：2016年5月：邦耀生物刘明耀、李大力团队发现了B型血友病FIX基因的新型突变Y371D，同时找到小鼠上对应的氨基酸位点Y381D，并且利用CRISPR/Cas9技术构建的重症B型血友病小鼠模型。然后创新性的利用AAV结合CRISPR/Cas9技术进行修复，极大的提高了F9Y381D血友病小鼠的凝血能力和断尾实验中的生存率[15]。
11月：宾夕法尼亚大学科学家们通过研究首次开发出了一种双基因疗法，其能够将CRISPR/Cas9介导的基因靶向系统的关键组分运输到小鼠机体中来治疗B型血友病。
12月：费城儿童医院科学家们已经开始进行了基因治疗白血病的临床1/2期试验。病人们在临床试验中接受了单剂量基因治疗，这些患者产生接近正常水平的凝血因子IX，允许他们暂停凝血因子输注，并且在日常生活未出现出血事件[16]。
肌肉萎缩症
杜氏肌营养不良症(DMD)是一种由于编码dystrophin蛋白的基因编码缺陷造成的隐性遗传性肌肉遗传病，每3500个新生男婴里就有一名DMD患者。
进展：2016年1月：杜克大学的科学家用CRISPR技术删除出现突变的外显子23，并引发机体自动“缝合”剩下的蛋白编码区域，制造出缩短但仍能发挥作用的新版本抗肌萎缩蛋白，使腿部的抗肌萎缩蛋白水平得到一定程度的恢复，肌肉力量增加[17]。
11月：中国科学家运用SaCRISPR/Cas9针对在恶病质中被激活进而诱导肌肉蛋白降解的myostatin信号通路，通过在体内靶向敲除肌肉中的myostatin达到了部分缓解恶病质的效果，达到延缓肌肉萎缩的治疗目的[18]。
临床试验：基因编辑公司EditasMedicine计划2017年开始治疗DMD的临床人体试验。
先天性利伯氏黑朦
先天性黑矇症(LCA)，是最早发生、最严重的遗传性视网膜病变，与数种基因包括RPE65，GUCY2D, CRX, RPGRIP1，CRBI和AIPL1等相关，美国的发病率为3.5万人/年。
临床试验：Editas实验室目前的研究表明，删除CEP290基因的那1000个碱基之后，CEP290基因的表达恢复正常。拟在2017年进行LCA10项目临床试验，将CRISPR基因编辑“工具”装载到病毒体内，再把病毒注射到患处，CRISPR可以自行对患病部位进行基因改造，使患者视力恢复正常。
1.3 病毒感染治疗
艾滋病毒HIV
之前，基于ZFNs技术治疗艾滋病CCR5的方法已经进入临床II期试验，而在经过适当的改进之后，CRISPR / Cas9系统被应用于人类细胞，为对抗外来DNA和病毒提供了新的思路。
拿HIV-1感染为例，科学家的结果表明CRISPR/Cas9系统可以破坏潜在已整合的病毒基因组，并产生长期的获得性防御机制以抵抗新的HIV-1病毒感染，表达和在人类细胞中的复制。
实验结果表明，72%的感染细胞中检测不到病毒，而且CRISPR/Cas9还同时减少了隐藏在细胞DNA内的处于休眠状态的HIV副本，更重要的是治疗能够维持对HIV的抵抗能力，避免再次被HIV所感染[19]。
乙肝病毒Hepatitis B
乙型肝炎病毒（HBV）仍然是全球健康威胁，因为慢性HBV感染可能导致肝硬化或癌症。最新的报道通过使用相同的gRNA/Cas9系统来抑制不同基因型的HBV，并探索多种gRNA/Cas9系统的可能性和效率。通过这项研究，科学家提供了抑制病毒复制和清除不同基因型的HBV的cccDNA的可能性[19]。
药物靶点的筛选
由于CRISPR/Cas9精确编辑，简单易操作的特点，使得这个技术在基因编辑领域大放异彩，更由于其相比shRNA具有更加高效的敲除效率，也使得大范围的基因功能筛选成为可能。将文库中的sgRNA和筛选marker结合在一起，便可以快速的筛选出全基因组范围内潜在的靶点基因[20]。
重大进展
2016年9月：科学家们在刚地弓形虫细胞中进行了全基因组范围的CRISPR/Cas9筛选，并找到了潜在的影响寄生虫的必需基因[21]。
12月：科学家们在RNF43突变的胰腺导管腺癌（PDAC）细胞中进行了全基因组范围的CRISPR-Cas9筛选，并找到了可以用于治疗该类型癌症的潜在抗体药物[22]。
12月：艾滋病毒的宿主蛋白对于病毒进入机体和自身复制来说非常重要，可能会是治疗的靶标。科学家们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术开始寻找在艾滋病毒感染治疗的靶标。通过全基因组筛选，发现了5个宿主因子，包括HIV共受体CD4 和CCR5，酪蛋白硫酸转移酶2TPST2和溶质载体家族35成员B2（SLC35B2）及活化白细胞粘附分子(ALCAM) [23]。
遗传育种
利用基因编辑技术改造动植物的基因表达，进而筛选优良的性状，实现更加高效定点的动植物育种。
重大进展
2016年4月：科学家们利用CRISPR/Cas9技术得到的工程化蘑菇已经开始种植并且售卖，通过对双孢蘑菇通过靶向编码多酚氧化酶（PPO）的基因家族使其能够抵抗蘑菇变为棕色[24]。
9月：孟山都宣布与麻省理工学院Broad研究院就CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业中的应用达成全球许可协议，希望能够为全球的农业提供一系列的作物改进技术，培育出更好的杂交品种。
12月：冷泉港实验室（CSHL）的研究团队通过CRISPR基因编辑技术成功使番茄的开花和成熟时间提前了两周多，并且拓展了这种重要农作物的种植范围[25]。
12月：中科院课题组，研究发现利用大鼠APOBEC1在水稻中开发了一种“碱基编辑”系统，它提供了一种简单高效的碱基置换方法，可用于植物研究和育种[26]。
参考文献
[1] Doudna J A, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J]. Science, 2014, 346(6213): 1258096-1258096.
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[3] Teachey, D.T., Chew, A., Hauck, B., Wright, J.F., et al. (2013). Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N. Engl. J. Med. 368,1509–1518.
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[26] Yuming Lu, Jian-kang Zhu. Precise editing of a target base in the rice genome using a modified CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant,2016.
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