CRISPR编辑过的细胞真的更容易致癌吗？原来只是虚惊一场！
前言
作为诺奖级别的技术--CRISPR/Cas9自2012年诞生后，争议一直不断！继2018年4月《Nature Methods》撤稿事件后，6月11日，著名国际期刊《自然医学》同时刊登了两篇文章[1,2]，提到Cas9在切割细胞基因组DNA后，p53通路会被激活引发细胞的凋亡反应。这本是很正常的细胞应激反应，然而部分媒体却发出了：“CRISPR/Cas9编辑成功的细胞很可能是潜在的癌细胞！”这样的声音。这再次引起了人们对于这项新技术安全性的质疑，甚至是恐慌。如此严重的“缺陷”一时间给Cas9的临床运用再次蒙上了一层阴影。小编在读到“Cas9致癌”的报道后特意研读了《自然医学》上的两篇论文，发现有关Cas9可能致癌的报道其实……并不成立。下面就让我们来分析一下。
文章1：p53 inhibits CRISPR–Cas9 engineering in human pluripotent stem cells[1]
中文题目：p53蛋白会抑制CRISPR-Cas9在人体多能干细胞内的（基因）编辑
作者单位：诺华生物医学研究所（美国）
文章2：CRISPR–Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response[2]
中文题目：CRISPR-Cas9在基因编辑的同时会引发p53介导的DNA损伤应激反应
作者单位：瑞典卡罗林斯卡学院
上述两篇文章研究内容很相似，都是主要论证了“在Cas9切割基因组DNA后能够激活细胞内的p53通路引起细胞周期阻滞和凋亡。”然而在经过国内外一些媒体断章取义的解读之后竟成了“被成功编辑的细胞往往会有p53功能缺陷”。这已经偏离了两篇论文本来的结论。由于这两篇论文内容相似，篇幅有限，小编主要来说一下来自诺华生物医学研究所的这篇报道。
看看标题，p53 inhibits CRISPR–Cas9 engineering in human pluripotent stem cells”，咦？好像和癌症没有关系么？我们再来看一下大致内容。
为了能够提高Cas9在人体多能干细胞内（hPSC）的基因编辑效率，诺华生物的科学家将dox诱导的iCas9整合入了hPSC内，并利用慢病毒导入sgRNA，每组细胞导入2-3个sgRNA。在dox的诱导下，该系统果然展示出了很高的编辑效率 -- 平均效率超90%。不过好景不长，实验组大部分的编辑成功的细胞都死了。
那究竟是什么原因导致细胞死亡？接下来作者进行了分析！
1. 一次导入几个sgRNA对hPSC来说太多？
研究人员将sgRNA换成一个靶向MAPT的sgRNA（这个基因的缺失不会导致细胞死亡），但即使只切割MAPT这一个靶点，细胞照旧大量死亡。结果如下图所示：
d 图， 在诱导Cas9切割MAPT基因后第5天和第10天的编辑效率；e图，诱导表达Cas9后第三天的细胞镜检（明场），可见原本密集的细胞间出现了大量空隙；f 图，诱导表达Cas9切割MAPT基因后1-7天细胞密度统计图
2. 难道是细胞暴露在Cas9的条件下太长？还是脱靶效应？
研究人员接连使用了半衰期比DNA更短的Cas9/sgRNA核糖蛋白（RNP），以及脱靶率更低的eCas9 dox诱导系统（ieCas9）。可惜结果都是——细胞大量死亡。更有意思的是，只要这个sgRNA是不切割基因组的非靶向sgRNA，细胞就不会死亡，所以看来也不是Cas9或者sgRNA本身的毒性。结果如下图所示：
g图，电转导入半衰期更短的的Cas9/sgRNA 核糖蛋白复合物后第0.75天和第5天的基因编辑效率。h图，导入核糖蛋白复合物5天后细胞镜检（明场）；i图，导入核糖蛋白复合物后1-5天
在hESC细胞系中诱导普通Cas9，精准型eCas9或者在8402ips细胞系中诱导精准型eCas9后1-5天内细胞密度统计图
3. 排除了上述原因后，目标锁定在了P53蛋白上
研究人员进一步探究细胞死亡的原因，进行了RNA seq以及各个信号通路之间相互作用的计算机模拟，最终将目标锁定在了p53蛋白上。p53在DNA断裂修复过程中的作用其实已经比较清楚。DNA在发生断裂后p53基因会被激活，进而激活下游的细胞周期调控蛋白p21使细胞被阻滞在G1期，这一机制是为了防止发生断裂的DNA被细胞盲目复制从而导致基因突变或DNA重排。如果DNA不能被及时修复，就会诱导细胞发生程序化凋亡或者衰老死亡。
为了证明p53通路确实是细胞死亡的原因，研究人员将hPSC的p53敲除，再做基因编辑。果然敲除p53后不但产生indel的细胞不凋亡了，甚至连细胞的HDR水平也提高了。到这里研究差不多结束了。
基因编辑敲除p53基因后（图中蓝色虚线），再进行DNA切割时细胞的存活率得到提高
利用p53缺失的细胞进行基因编辑连HDR的效率也得到了提升
由此，诺华的科学家得出了这几个结论
找到了影响多能干细胞编辑效率的原因 -- p53引起的细胞凋亡；
抑制p53可以提高HDR。当然研究人员也指出，p53基因是DNA完整性的保证，长时间抑制p53可能导致细胞内累计大量的DNA突变。研究人员建议瞬时抑制p53可能是找到DNA完整性和HDR效率间平衡的方法。注意这里的抑制是加入其它p53的抑制剂。Cas9本身并不能抑制p53通路，更不会导致p53蛋白失活，恰恰相反Cas9是激活p53通路，不然也就不会有文章开头hPSC编辑效率低这回事了。
那是什么导致了文章结论被误读呢？
原来根源可能在于：研究人员根据此结果对基因治疗提出的一些建议。在他们的实验中，如果多能细胞自身带有p53突变（有潜在致癌风险），那么在接受Cas9编辑之后，这些细胞往往更不容易凋亡，他们更容易存活，如果基因编辑将这些细胞富集后再输回病人体内就糟糕了。所以他们提出在将来需要先对患者的基因组测序，评估p53的自发突变水平再进行基因编辑治疗。这本来是一个不错的建议。
然而媒体在理解上却大多存在两个问题：
Cas9的编辑造成了p53的失活。其实在两篇报道中，都没有提到这一点。
Cas9编辑成功的细胞都是或者大多都是p53已经失活的。其实这一点取决于研究人员所用细胞系p53的初始突变率，初始突变率越高，编辑过后筛选到的p53突变细胞自然就越多。然而到了现实中，遗传疾病患者的干细胞很可能不存在p53蛋白的突变，所以筛选也就无从说起。另外Cas9编辑对p53缺失细胞的富集能力在文章中也没有更加详细的实验。比如在p53自发突变率高于某一个阈值的情况下Cas9编辑才能够富集大量的癌化细胞。
小编也很好奇，在作者最初的实验中那些经过Cas9编辑存活下来的少数细胞中p53突变的概率前后到底有多大的变化呢？这些成功编辑的细胞如果继续培养有多少会累计其他突变？ 另外在不同的细胞系中这种富集作用的强弱也有待验证。
正如加州大学伯克利分校的Jacob Corn教授所说，“我们在自己的实验中也发现过p53被激活的现象。所以我们在造血干细胞的（基因编辑）实验中很仔细的观察细胞有没有生长异常，结果是......并没有。当然这并不能说明Ihry文是错的。因为很重要的一点是细胞系不同。
同时也有许多专家们指出，他们尚未在小鼠实验中看到由于CRISPR基因编辑导致的肿瘤爆发，因此这两篇论文的发现可能在临床上的负面影响有限；邦耀实验室至今也利用CRISPR/Cas9技术构建了多种大/小鼠模型，经过长期饲养观察，同样没有在大/小鼠上观察到CRISPR/Cas9构建的大/小鼠模型有更容易患癌症的倾向。所以CRISPR编辑过的细胞致癌？可能并不成立…至少现在看来需要更多研究来验证！
参考文献：
[1] Ihry RJ, et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med.2018.
[2] Haapaniemi E, et al.CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response.Nat Med.2018.
邦耀实验室致力于开发基因编辑技术在肿瘤免疫（CAR-T和TCR-T）和遗传疾病中的治疗，利用完善的新药研发平台，进行小分子及抗体药物研发
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