JACS| 酶激活金纳米颗粒用于位点选择性的生物偶联

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金纳米颗粒(AuNP)具有独特的化学和光学性质，经常与蛋白质、多肽或核酸进行偶联，用于癌症治疗、诊断和生物传感器。生成蛋白质-AuNP偶联物的最常见方法是物理吸附，但是物理吸附的蛋白质的取向不受控制，可能导致蛋白质功能的丧失。常见的共价连接方法是蛋白质上的赖氨酸残基与AuNP上的羧酸单层之间形成酰胺键，但这也会导致蛋白质的随机修饰和取向。此外，蛋白质的半胱氨酸可以通过金-硫相互作用直接与AuNP偶联，但是，由于缺少预先修饰的单层膜，因此可能导致非特异性蛋白结合，并可能限制AuNP的稳定性。

另一方面，通过“盐老化”的方法将含有巯基的DNA偶联到AuNP上，方法简单，原料便宜，已取得显著的成效。然而该方法难以得到低密度的DNA-AuNP偶联物，且实验条件不适用于敏感的蛋白质，因此需要开发一种对DNA和蛋白质都相容的、且能得到低密度DNA-AuNP的方法。

图1. 用硫醇-PEG5k-苯酚或硫醇-PEG2k-甲氧基对AuNP进行单层功能化

近年来，作者通过邻醌类中间体与亲核试剂的反应，开发了一种快速有效的生物分子氧化偶联方法，其中邻醌类中间体可以由苯酚通过酪氨酸酶(Tyr)催化得到。因此，如图1，作者设计了用于AuNP功能化的硫醇-PEG5k-苯酚配体，长的PEG链用以屏蔽AuNP表面并防止聚集，并以甲氧基的配体作为对照。动态光散射(DLS)和盐稳定性测试确认了单层形成。

随后作者探究了AuNP的表面酚能否被Tyr氧化，琼脂糖凝胶电泳分析显示，Tyr作用后的AuNP的电泳迁移率显著降低，这表明表面化学发生了变化。接下来，作者加入了含有巯基或N端脯氨酸的蛋白质(如图2)，琼脂糖凝胶电泳证明了AuNP和蛋白质的成功偶联，且都可以在2小时内确保完成。酶活结果显示，固定后的醛缩酶仍有活性，但有所降低，作者认为这很可能是由于四个活性位点中的一个或多个受阻而不是破坏了蛋白质二级结构。

图2. 含有巯基或N端脯氨酸的蛋白质与苯酚-AuNPs的偶联

接下来作者用AuNP和不同浓度的DNA进行反应，并用天然凝胶电泳进行监测，结果表明在整个DNA的测试浓度范围内(20-80 μM)，DNA的偶联均成功。该方法反应时间短、酶促控制以及可以产生低密度但稳定的DNA-AuNP偶联物。

最后，为了突出蛋白质-AuNP偶联物的实用性，作者使用这种酶促生物偶联技术将染料标记的含苯胺的烟草花叶病毒蛋白(TMV)偶联到AuNP上，并通过天然凝胶电泳和荧光分析法进行分析(如图3)。两种表征技术均表明，当两者进行偶联时，会发生荧光淬灭，证明了染料与AuNPs之间的能量转移。

图3. 染料标记的TMV与苯酚-AuNPs的偶联以及凝胶电泳、荧光光谱

综上所述，作者通过酪氨酸酶活化AuNP的表面的酚单层，进而得到生物分子-AuNP的偶联物。该反应可以在2小时之内完成，具有位点特异性，且对DNA和蛋白质都兼容，有望在未来的生物应用中成为有利工具。

该研究以：Enzyme Activated Gold Nanoparticles for Versatile Site-Selective Bioconjugation为题，发表在JACS上。在本文中，作者开发了一种新的酶促方法，用于构建蛋白质和DNA-AuNPs偶联物。该工作的通讯作者是来自加州大学伯克利分校化学系的Matthew B. Francis教授。

原文链接
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c11678?ref=pdf

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