青岛大学周祺惠团队/附属医院卢云团队《AFM》：用于腹壁缺损修复的生物多功能水凝胶补片

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因先天性薄弱、外伤、肿瘤术后导致的腹壁缺损是近年来常见的外科临床问题。腹壁缺损可能导致疝气的发生，致使肠梗阻甚至于肠坏死，进而危及生命。目前，外科手术为治疗腹壁缺损的金标准，但传统的直接缝合方法因极高的复发率被无张力补片修补术而替代。普外科医生通常使用永久性聚合物网片[如聚丙烯网片(PP)]来加固缺损区域。然而，这种网片会诱发明显的异物反应并导致组织纤维化，可能会导致慢性疼痛并在术后进一步限制患者正常运动。此外，传统补片不具有粘附性，需要丝线固定，延长了手术操作时间，加大暴露风险。由于修补材料不可吸收，会导致一系列并发症，包括肠糜烂和患者体力活动受限等。此外，使用生物补片如猪小肠粘膜和真皮是修复腹壁缺损的替代策略。但是，生物补片的应用仍然受到其过程复杂、强度低和成本高的限制。因此，亟需开发一种使用方便、微创治疗、仿生、湿态下高粘附、良好机械性能、抗菌和促进组织修复的生物多功能补片用于腹壁缺损修复。

针对上述临床问题和需求，青岛大学转化医学研究院周祺惠特聘教授团队/附属医院普外科卢云主任团队基于席夫碱反应开发了一种生物多功能羧甲基壳聚糖（CMCS）和四臂聚（乙二醇）醛（4-arm-PEG-CHO）水凝胶补片用于全层腹壁缺损修复。所设计和制备的水凝胶表现出优异的自愈性和机械性能，在湿态下具有高粘附力，以及显著的抗菌能力。另外，体外细胞实验表明，所制备的水凝胶加载重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rb-bFGF）后可以显著促进细胞增殖和迁移，进而加快了大鼠模型中全层腹壁缺损修复。组织形态学实验表明，与临床常用的商品化PP补片相比，所开发的水凝胶补片能够通过上调 Ki67的产生促进腹壁组织的修复和增厚，诱导胶原蛋白和新生血管形成，同时可以通过减少IL-6、TNF-α和IL-1β的表达来抑制炎症。这些结果表明，这种新型生物多功能水凝胶补片在治疗全层腹壁缺损方面具有巨大潜力。

图1. 生物多功能水凝胶补片的制备及其在全层腹壁缺损修复中的应用。

如图2（A）所示，¹H核磁光谱结果表明存在醛基(10.04 ppm)、苯环(8.14–8.16、7.88–7.90 ppm)和酯基(4.45 ppm) 质子的峰，表明成功合成出4-arm-PEG-CHO。如图2（B）的红外光谱结果所示，4-arm-PEG-CHO 中1703和1723 cm^-1处的峰归属于–C=O ，这进一步表明–CHO 的成功引入。水凝胶中1713 cm^-1处的峰证实了CMCS的氨基与4-arm-PEG-CHO的醛基之间发生席夫碱。为了研究不同组分比例的水凝胶的成胶特性，他们配置了三种不同比例的水凝胶(4-arm-PEG-CHO/CMCS重量比为 4:1、2:1 和 8:7，分别对应命名为凝胶1、2和3)。由于外科医生在手术过程中需要时间来微调补片覆盖的区域，所以3–5分钟是最适合的成胶时间。如图2（C）/（D） 所示，不同组分比例的水凝胶室温下成胶时间满足上述要求。

图2. (A) 4-arm-PEG-CHO的¹H核磁光谱图。(B) CMCS、4-arm-PEG-CHO和水凝胶的红外光谱图。(C) CMCS 溶液、用红色颜料染色的4-arm-PEG-CHO溶液和所形成的水凝胶照片。(D) 凝胶1、2和3的成胶时间。

用于腹壁缺损修复的水凝胶应具有较强的湿态下组织粘附力，能够长时间黏附于腹壁上并承受腹内压力。如图3所示，凝胶1、2和3的平均爆裂压力分别为217.5、150.0和90.0 mmHg，显著高于正常腹内压（5 mmHg），甚至高于IV级腹腔筋膜室综合症的压力（25 mmHg）。水凝胶1和2还可以满足因咳嗽、打喷嚏等引起的腹内压快速升高这一情况的要求。另外，在模拟体内生理环境下，6天后水凝胶对湿润皮肤仍表现出良好的粘附性能，可以有效防止水凝胶在手术后移位。体外剪切黏附试验可以检测腹壁缺损修复术后因粘附性不足引起补片脱落。在体外搭接剪切试验中，如图 3（D） 所示，水凝胶2紧密粘附在两片猪皮上，并能承受了200 g的负荷。

图3. (A) 凝胶1–3的平均爆破压力。(B) 爆破压力测试示意图。(C) 剪切黏附试验示意图。(D) 凝胶2在猪皮上的剪切黏附力（重量 = 200 克）的照片。(E) 凝胶 1–3 的平均剪切黏附力。

为了评估水凝胶的自愈能力，他们分别进行了宏观自愈观察和流变自愈测试。如图4（A）所示，没有任何外部刺激的情况下，被切割后的水凝胶再次愈合成完整的蝴蝶形水凝胶，并且自愈合后的水凝胶强度足以支撑自身重量。为了进一步评估水凝胶的自修复特性，基于10 rad/s的角频率进行流变恢复测试。当应力加大到（γ=200%）时水凝胶的G'从37 kPa急降到3.7 kPa，并且G" > G'，表明水凝胶网络已被破坏，应力恢复到初始状态后，G'和G"立即恢复了原始值。经过多次循环后，G'没有显著下降（图 4（C））。这种水凝胶的自愈作用主要取决于水凝胶中动态官能团之间的动态反应。在临床上的应用意义为：如果患者术后切口受损，补片发生破裂，水凝胶可自愈合，有效防止复发。

图4. (A) 蝴蝶形水凝胶宏观自愈的照片。(B) 应变幅度扫描(γ=1–1000%)在固定角频率(10 rad/s)下水凝胶2的G' 和 G"。(C) 以 1 和 200% 的应力下进行流变恢复测试。

一般来说，无张力腹壁缺损修补手术会存在不可避免的感染风险，因此水凝胶补片除了作为物理屏障外，还应具有一定的抗菌特性。在体外抗菌测定中，采用菌落法（CFU）来研究水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。图5（A）显示所有水凝胶均对两种细菌显示出一定的抗菌作用。为了更好地了解不同样品的抗菌活性，通过细菌菌落数来计算抑菌率。如图5（B）/（C）所示，随着水凝胶中CMCS比例的增加，抗菌活性增强。可能由于CMCS同带负电荷的细菌表面结合，扰乱细胞膜，细胞内成分泄漏而导致细菌死亡。此外，动态希夫碱在水凝胶中起着重要的抗菌作用。总体而言，这种水凝胶具有一定的抗菌活性，用作腹壁缺损补片时可以减少细菌感染的发生。另外，具有止血功能的水凝胶可以减少手术中电凝的使用，有利于组织修复和新生血管的形成。为了证实水凝胶的止血效果，他们以使用肝素化的小鼠全血为模型，测量了水凝胶的血液凝固效果。当分别与4-arm-PEG-CHO和CMCS混合后，血液没有凝固。而当全血与水凝胶混合时，水凝胶可以有效地封闭血液，在PBS中浸没30分钟后，水凝胶中仍然没有血性物质渗出。血液的凝胶化主要归因于苯甲醛和氨基之间的席夫碱反应，以及水凝胶的溶胀作用。

图5. (A) 与水凝胶共培养后琼脂板上存活细菌菌落的照片。(B, C) 水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率。(D) 水凝胶的止血效果图片。

为了加速组织修复，rb-bFGF被引入到水凝胶中。他们分别将添加和未添加rb-bFGF 的水凝胶与人成纤维细胞进行共培养。如图6（A）所示，所有样品中的人成纤维细胞具有典型的纺锤形貌以及相似的细胞数量。此外，他们还进行了活死细胞染色以评估水凝胶的细胞毒性（图 6（B）/（C））。结果表明，水凝胶与人成纤维细胞共培养1天后，各组细胞存活率均大于99%，所有组之间没有显著差异。如图6（D）所示，第 1、3和5天的 CCK-8 检测结果显示，与对照组相比，添加rb-bFGF的水凝胶组在第三天时细胞数量显著增加，并在第5天仍保持增加的趋势。所有这些结果表明，该水凝胶作为腹壁缺损补片具有优异的细胞相容性。细胞划痕试验被用来研究水凝胶对细胞迁移的影响 (图6（E）)。细胞被孵育 24 小时后，凝胶2+rb-bFGF组实现了最快的划痕闭合（细胞覆盖面积的 89.5%）。凝胶1–3和对照组之间没有显著差异。综上所述，凝胶2 + rb-bFGF 样品显著促进细胞增殖和迁移，显示出对腹壁缺损修复的巨大潜力。

图 6. (A) 人成纤维细胞与水凝胶1–3共培养 24 小时的荧光图像。红色表示通过 TRITC-鬼笔环肽染色的肌动蛋白，蓝色表示通过DAPI染色的细胞核。(B, C) 人成纤维细胞与水凝胶共培养 24 小时后的活/死染色荧光图像和定量分析。红色荧光代表死细胞，绿色代表活细胞。(D) 水凝胶与成纤维细胞孵育 1、3 和 5 天后的细胞增殖情况。(E) 划痕处理后0、2、6、12和24小时各组细胞覆盖占比。

大鼠腹壁缺损修复实验被用来评估水凝胶在体内条件下的腹壁修补能力。如图7（A）所示，术后14、30和120 天，添加了rb-bFGF的凝胶2组和阳性对照组（PP网）均未观察到动物死亡或疝气发生。14天时，在水凝胶补片组观察到纤维结缔组织生长、新生血管形成和腹壁组织边界消失。30天时，原有腹部缺损处充满纤维结缔组织，组织内可见新生血管。120天时，再生组织的厚度与正常腹壁的厚度几乎相同。在 PP 网片组中，各个时间段均存在有不同程度的炎症反应，同时腹壁和皮肤之间有大量的组织粘连。此外，与PP补片组相比，水凝胶组在手术过程中无需进一步固定，大大缩短了手术时间，避免了丝固定所造成的组织损伤。

如图 7 （C）/（D） ，手术部位的组织病理学检查显示出水凝胶组有良好的组织相容性、无明显炎症反应和促进血管生成的能力。PP组周围组织的炎症在实验过程中持续存在。炎症细胞主要聚集在PP细丝表面，存在慢性炎症。新生血管的形成是评价修复效果的重要指标，如图 8（B） 所示，在第14、30和120天，水凝胶组的血管数量明显高于PP组。Masson染色胶原沉积（图7（E）/（F））实验结果显示，与PP组相比，水凝胶修复的腹壁缺损处形成了更多胶原蛋白。

图 7. (A) 大鼠全层腹壁缺损模型示意图。(B) 在第 0、14、30 和 120 天用添加 rb-bFGF 的水凝胶 2 和 PP补片处理后的腹壁组织照片。(C) 在第 14、30和120天，PP和Gel 2+rb-bFGF组的H&E 染色分析。红色箭头表示新生血管。(D) 第 14、30 和 120 天新生血管的定量分析。(E) 第 14、30 和 120 天腹壁缺损的 Masson染色图像。蓝色区域表示腹壁缺损处新沉积的胶原纤维。(F) 胶原形成的定量分析。

最后，通过免疫组织化学染色检测IL-6、IL-1β 和 TNF-α等在慢性炎症、自身免疫和传染病中发挥重要作用的炎症因子以评估腹壁缺损修复中的炎症反应（图 8（A）/（B））。结果显示，PP组IL-6、IL-1β和TNF-α阳性细胞密度明显高于Gel 2+rb-bFGF组，进一步证实了水凝胶组的抗炎活性。此外，如图 8（C）/（D）所示，在第 14 天，使用添加 rb-bFGF 的 Gel 2补片治疗的腹壁缺损处Ki67表达量明显高于PP组。第30天和第120天两组Ki67表达无显著差异，这一结果可能是由于加载rb-bFGF的水凝胶在早期已释放完全。综上所述，与传统的PP补片相比，加载生长因子的水凝胶补片可以通过下调IL-6、IL-1β和TNF-α的表达来减少慢性炎症的发生。早期通过对rb-bFGF的缓慢释放，增加Ki67的表达，进而显著促进细胞增殖。

图 8. (A, B) IL-6 和 (C, D) Ki67 在第 14、30和120天的免疫组织化学染色和定量数据。

以上相关工作以“Bio-Multifunctional Hydrogel Patches for Repairing Full-Thickness Abdominal Wall Defect”为题，发表在《Advanced Functional Materials》杂志上(DOI: 10.1002/adfm.202105614)。本文第一作者为青岛大学硕士研究生尹祥意和共同第一作者为博士后郝源萍，通讯作者为青岛大学转化医学院周祺惠特聘教授和附属医院胃肠外科副主任医师胡继霖。

该工作得到了国家自然科学基金（No. 31900957），山东省自然科学基金（No. ZR2019QC007）和山东省高等学校青创科技计划（No. 2019KJE015）的支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202105614

另外，周祺惠特聘教授在“（干）细胞与生物材料界面相互作用”和“新型生物医用材料的设计、制备及其在生物医学方面应用”等方面发表研究论文多篇：(1) Chemical Reviews 2021, 121: 4561；(2) Science Advances 2020, 6: eaay2756；(3) Journal of Nanobiotechnology 2021, 19:216；(4) ACS Applied Materials & Interfaces 2021, 13: 17289; (5) Carbohydrate Polymers 2021, 10.1016/j.carbpol.2021.118493; (6) Materials & Design 2020, 193: 108863; (7) International Journal of Biological Macromolecules 2021, 180: 599等。更多信息详见周祺惠特聘教授课题组网站：https://www.x-mol.com/groups/BMTMers，课题组微信公众号：“生物材料与转化医学课题组”。

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