福建医大曾永毅/张晓龙团队《ACS AMI》：聚合物点仿生红细胞纳米囊泡在NIR-II荧光引导下光动力和化学动力协同治疗乏氧肿瘤

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光动力疗法（PDT）具有高时空选择性、低全身毒性、低内在抗性和最小侵袭性等优点，是一种有效且有前途的癌症治疗方法。然而，常规光敏剂较低的生物利用度、光动力过程氧依赖性和肿瘤乏氧微环境特征等极大地限制了目前肿瘤光动力治疗疗效。因此，如何提高光动力三要素（光敏剂、光源、氧）在肿瘤部位的利用度是增强乏氧肿瘤光动力疗效的关键问题。
    目前，福建医科大学孟超肝胆医院曾永毅/张晓龙团队开发一种基于血红蛋白（Hb）修饰聚合物点（SPNs）的仿生红细胞纳米囊泡（SPN-Hb@RBCM），实现NIR-II荧光引导下光动力和化学动力协同治疗乏氧肿瘤（Scheme 1）。首先，聚（苯乙烯-马来酸酐）（PSMA）与共轭聚合物聚（环戊二噻吩-alt-苯并噻二唑）（PCPDTBT）通过纳米沉淀法制备得羧基封端的纳米粒子（SPNs）。接下来，通过胺基团（Hb）和羧基基团（SPNs）的碳二亚胺反应将Hb 共价修饰到SPNs上（SPN-Hb）。然后，将SPN-Hb与提取的红细胞膜（RBCM）经聚碳酸酯多孔膜挤压多次制备RBCM伪装的仿生囊泡（SPN-Hb@RBCM），负载氧气后得SPN-Hb-oxy@RBCM诊疗仿生纳米囊泡。在SPN-Hb-oxy@RBCM中，SPN具有优异的NIR-II荧光、良好光稳定性和光动力活性，Hb具有优秀的氧气携带能力和催化肿瘤过氧化氢产生羟基自由基能力（用于化学动力治疗，CDT），RBCM延长纳米囊泡的系统循环时间并促进其在肿瘤中的聚集。在肿瘤部位富集后，NIR光（808 nm）照射下，SPN-Hb-oxy@RBCM可实现NIR-II荧光成像引导乏氧肿瘤协同增强化学动力/光动力治疗。 
Scheme 1. SPN-Hb@RBCM仿生红细胞纳米囊泡的合成及其成像引导光动力治疗和化学动力治疗乏氧肿瘤示意图。 从TEM图片可见SPN-Hb@RBCM 具有明显的囊泡结构，DLS测量分析其粒径在80 nm左右，从吸收光谱和蛋白质电泳可见Hb成功负载于SPN及SPN-Hb@RBCM，同时SPN-Hb@RBCM具有优异NIR-II荧光性能和光稳定性（图1）。SPN-Hb-oxy@RBCM在常氧和乏氧条件都具有优秀的ROS产生能力，其在乏氧条件可以有效缓慢释放氧气，在过氧化氢存在下可以有效产生羟基自由基（图2）。  
图1. 仿生纳米囊泡合成示意图及理化性质表征（TEM电镜（B-C）、粒径分析（D）、电位分析（E）、吸收光谱分析（F-G）、蛋白质电泳（H）、NIR-II荧光光谱（I）和808 nm激光照射稳定性评估（J））。 
图2. 仿生纳米囊泡体外光照活性氧产生能力（B-E）、携氧缓释能力（F）、催化过氧化氢产生羟基自由基能力评估（G-H）。 通过细胞实验（图3），作者验证了仿生纳米囊泡（FITC标记）可以有效被肝癌细胞（SMMC-7721）摄取，因为RBCM的伪装（SPN-Hb@RBCM）能够降低巨噬细胞对纳米颗粒的内化，从而减少网状内皮系统（RES）的捕获。SPN-Hb-oxy@RBCM可以催化H₂O₂产生羟基自由基，在光照下，SPN-Hb-oxy@RBCM有效缓解肿瘤细胞在光动力过程中氧气的不足，增强了 ROS 的产生。通过进一步的细胞实验（图4），作者证明了纳米囊泡低暗毒性和良好的光动力治疗能力，同时在乏氧条件下也可以通过光动力有效杀伤肿瘤细胞。 
图3. 荧光标记仿生纳米囊泡的肿瘤细胞摄取行为（A），降低巨噬细胞吞噬摄取能力（B-D），DCFH-DA成像细胞内ROS产生行为（E），[Ru(dpp)₃]Cl₂成像纳米囊泡缓解光动力引起乏氧能力（F）。 
图4. 仿生纳米囊泡在细胞层面的肿瘤治疗评价。CCK-8实验（A-C），活死染色（D）和流式细胞凋亡分析（E）。 因为SPN优异的NIR-II荧光性能，作者通过NIR-II荧光成像验证了SPN-Hb@RBCM有效的肿瘤富集行为，RBCM 的包覆使SPN-Hb具有更长的血液循环半衰期，有利于纳米囊泡体内循环以及对网状内皮系统（RES）的逃逸（图5）。如图6所示，尾静脉注射纳米囊泡后，通过监测肿瘤体积生长、小鼠体重变化，及对治疗后的小鼠肿瘤重量测量和拍照，证明SPN-oxy-Hb@RBCM光照治疗组具有最佳抗肿瘤治疗效果。通过 H&E、Ki67 和 TUNEL 染色观察不同处理组肿瘤组织切片，SPN-oxy-Hb@RBCM 纳米药物加激光照射组具有最佳肿瘤治疗效果。免疫荧光成像肿瘤内源性 HIF-1α证明SPN-oxy-Hb@RBCM 纳米药物可克服光动力治疗后肿瘤缺氧。 
图5. 仿生纳米囊泡SPN-Hb@RBCM具有增强体内循环和肿瘤富集能力（B-D：体内及器官中NIR-II荧光成像，E-F：NIR-II荧光评估血液中纳米囊泡药物代谢行为）。 
图6. 仿生纳米囊泡的体内抗肿瘤治疗评估。 综上，该团队开发了一种红细胞仿生纳米囊泡用于协同增强乏氧肿瘤的化学动力/光动力治疗。该仿生纳米囊泡保留了红细胞膜的生物相容性，延长纳米试剂体内循环时间从而增强了其在肿瘤部位的富集。在808 nm 激光照射下， SPN-oxy-Hb@RBCM 纳米囊泡有效产生活性氧，同时 oxy-Hb 为加剧缺氧的肿瘤补充外源氧气，增强PDT疗效。另外，Hb催化肿瘤微环境中高浓度 H₂O₂进行 CDT。仿生纳米囊泡通过PDT和 CDT 的联合作用显著增强了乏氧肿瘤治疗效果。总之，克服肿瘤乏氧的 PDT和 CDT的协同治疗模式，有效提高乏氧肿瘤治疗疗效，具有进一步临床转化应用前景。
该工作以“Engineered Red Blood Cell Biomimetic Nanovesicle with Oxygen Self-Supply for Near-Infrared-II Fluorescence-Guided Synergetic Chemo-Photodynamic Therapy against Hypoxic Tumors”为题，发表于《ACS Applied Materials & Interfaces》上（10.1021/acsami.1c19096）。博士生丁磊、硕士生吴滟坭为本文共同第一作者，通讯作者为福建医科大学孟超肝胆医院张晓龙副教授、曾永毅教授。该论文得到了国家自然科学基金、福建省自然科学基金等项目支持。

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https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.1c19096

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