【ESE研究论文】基于⾃动化液体处理系统策略的标准化⾼通量⽣物监测方法

文章亮点

1. 提出了利用机器平台进行⾼通量DNA宏条形码的概念；

2. 以河流⽣物样本验证了该方法的可靠性；

3. 获得了始终⼀致且⽆污染的⾼通量数据；

4. 自动化机器流程可以降低生物监测的成本并提⾼数据的稳定性。

主要内容

可靠且⼴泛的生物监测数据对追踪和保持⽣物多样性至关重要。⽬前尚缺乏公认的能获得⾼分辨率⽣物多样性数据的监测⽅法。此外，基于全系统多样性的管理与效应评价的方法仍不够成熟。

人们常根据表型特征（如显微观察）鉴定传统的真核生物多样性，但这一⽅法的分辨率较低。目前，还缺少很多⽣物的多样性数据——如昆虫——当然也就⽆法评价它们的多样性变化趋势。DNA⾼通量测序方法主要用于分析从⽔、沉积物、⼟壤、植物或空⽓中收集到的环境样本及其⽣物多样性。基于DNA的多样性评价⽅法在过去⼗年间迅速发展，现有操作⼏乎遵循着相同的流程（扩增、建库、测序和⽣信分析）。标准化质量控制的测试⽅法对于提⾼大规模实验数据的可靠性而言⼗分重要。其中， DNA宏条形码技术是一种用高通量测序方法监测特定基因的DNA序列，从而快速鉴别生物物种的技术。DNA宏条形码技术极⼤地促进了⽣物测试能力，特别是对从淡⽔和沉积泥中采集到的群落样本DNA，并能在降低操作难度和成本的同时覆盖到整个生物圈。利用DNA宏条形码技术可以同一时间测试上百个样本。但该技术⽬前主要依赖于⼿动操作，缺乏可靠的全⾃动操作⽅法。

为了减少⼈为操作、避免交叉污染、实现⼤规模的96孔板⾼通量测序，作者开发了⼀种标准化的、可推广的DNA宏条形码测试技术，并采⽤⾃动化液体操作台（图1）。为了验证该⾃动化流程的可靠性，作者以线粒体细胞⾊素c氧化酶亚基I（COI）基因作为⽣物标记建⽴了两个数据库：数据库1是由不同的节肢动物组成的，相当于纯物种样本；数据库2是直接从河水中获取的环境样品，相当于动物混合样本。

实验设置

作者通过DNA宏条形码技术分析上述两类样本的生物多样性（图1右），特别之处在于利用了Biomek FXP自动化工作站完成样本均质化（homogenization）之后的操作。具体过程如下。

数据库1：由42种不同的节肢动物组成，并设置平行组（图1左）。将样本干燥、研磨均匀后溶解于10 mL TNES缓冲溶液中。之后的操作主要通过Biomek FXP自动化工作站完成。样本被等量添加到2个96孔板中，每个96孔板设有12个空白对照，用于分析操作过程中样本的污染情况。通过NucleoMag Tissue kit提取DNA。通过特定引物和通用标记引物依次进行2步PCR扩增。PCR产物经标准化后合并。依据序列大小去除引物前体。经质量控制后通过Illumina测序，最后进行生物信息分析。

数据库2：从淡水河中采集混合样本。手动切取样本的一部分（如样本的腿或腹部），将样本干燥、研磨均匀后溶解于10 mL TNES缓冲溶液中。之后的操作与上述过程相同。

主要结果

数据库1：根据97%的相似性，共获得152个OTU s，其中97个OTUs的相对丰度⾼于0.01%。这些OTUs分属于节⾜动物⻔（89个OTUs）、⼦囊菌⻔、硅藻⻔、担⼦菌⻔和刺胞动物⻔等。其中，尽管29个样本在形态上和DNA上存在⼀定差异，但是被归为同⼀⻔类。

数据库2：通过DNA宏条码技术分析从某淡⽔河中获得的样本，共获得1720个OTU s，其中972个OTUs的相对丰度⾼于0.01%。这些OTUs被分类为四节蜉属、叉錞属和⻰虱属等。所有样本都表现出充⾜的测序深度。

结论

本研究提供了⼀种⾃动化的、可⼤规模应用的、重复性好的DNA宏条形码测试流程，包括利⽤自动化液体处理系统从混合样本中提取DNA、 PCR扩展和建⽴数据库。作者构建了两个数据库：⼀个是基于42种不同的节肢动物样本的验证数据集，另⼀个是基于从河流中收集的60个⼤型⽆脊椎动物混合样本的常规监测数据集。作者以线粒体COI基因作为⽣物标记，验证了这一基于自动化液体处理系统的DNA宏条形码技术可以获得⽆污染、⾼质量、可重复的测试结果。

文章配图

图1 ⾃动化DNA宏条形码测试流程示意图

论文信息

第一作者｜Dominik Buchner和Till-Hendrik Macher为本文共同第一作者，德国杜伊斯堡-埃森大学。

原文题目｜Standardized high-throughput biomonitoring using DNA metabarcoding: Strategies for the adoption of automated liquid handlers

引用信息｜Buchner, D., Macher, T. H., Beermann, A. J., Werner, M. T., & Leese,  F. (2021). Standardized high-throughput biomonitoring using DNA  metabarcoding: Strategies for the adoption of automated liquid handlers. Environmental Science and Ecotechnology 8: 100122.

doi:https://doi.org/10.1016/j.ese.2021.100122

初稿｜王柯幻，中国科学院微生物研究所

审校｜杨珍妮、陈卓

编辑｜陈卓

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