Koeken——使LEfSe分析更便捷

上一篇为LEfSe分析写了教程，包括LEfSe计算原理概述、输入文件如何准备、在线Galaxy平台运行LEfSe、本地LEfSe工具的安装使用以及对结果的说明等。因此，对LEfSe的基础部分可参考前文。

特别提到了如何由OTU丰度表转换获得LEfSe的输入文件，并提供了转换的代码。转换过程中借助QIIME工具实现各分类水平的统计，需要事先将txt格式的OTU丰度表转换为biom格式以方便使QIIME识别。

既然已经将OTU表转换为biom格式，并也已安装了QIIME和LEfSe程序，那就继续延伸一个工具，Koeken，是为LEfSe分析提供的包装器。Koeken将QIIME和LEfSe结合在一起，为从QIIME OTU表到微生物类群生物标志物的鉴定提供了更便捷的工作流程，输入biom格式的带注释OTU丰度表和带有分组信息的mapping文件，即可直接运行获得LEfSe分析结果。

Koeken的github链接：https://github.com/twbattaglia/koeken

本篇简介Koeken的安装和使用过程。

Koeken的安装

首先安装Koeken。

#使用 pip 安装 Koeken
pip install https://github.com/twbattaglia/koeken/zipball/master
koeken.py --help

#或者编译安装
wget https://codeload.github.com/twbattaglia/koeken/zip/master
unzip master
cd koeken-master
python setup.py install
koeken.py --help

#或者 conda 安装
conda install Koeken
koeken.py --help

文件准备

Koeken的输入文件包括OTU丰度表和样本分组文件。

OTU表转化为biom格式，用过QIIME的同学应该对它不陌生；样本分组信息包含在mapping文件里，mapping文件也是QIIME的标准配置文件。

对于biom格式和mapping文件的简介可参考QIIME文档：

http://qiime.org/documentation/file_formats.html#mapping-file-overview

某试验对微生物群落添加某种处理，分为对照组和处理组，并在处理后的第2、3、4天取样，16S高通量测序获得细菌群落数据。

#示例数据可获取自 https://pan.baidu.com/s/1ctwyoTqT1ofygMUnTj7CPA
#otu_table.txt，OTU 丰度表
#otu_tax.txt，OTU 注释文件，数据库随意
#mapping.txt，QIIME 的 mapping 配置文件，含样本分组信息

#常见的 OTU 丰度表转为 biom 格式，并添加 OTU 注释信息
cp otu_table.txt otu_table.tsv
sed -i '1i\# Constructed from biom file' otu_table.tsv
biom convert -i otu_table.tsv -o otu_table.biom --table-type="OTU table" --to-json
biom add-metadata -i otu_table.biom --observation-metadata-fp otu_tax.txt -o otu_table.tax.biom \
--sc-separated taxonomy --observation-header OTUID,taxonomy

运行Koeken

我们期望在每个时间点，比较处理和对照的细菌群落差异，从中找到最具代表性的差异类群。

然后以下是一个简单示例，展示Koeken运行。分别代表时间和处理的变量，Day和Treatment，已经添加在mapping文件中，分析时指定该列即可。

#运行 Koeken 的一个简单示例，细节参数详见 koeken.py --help
#例如，设定统计检验显著性 p 值 0.05，LDA 得分值 2.0
koeken.py --input otu_table.tax.biom --map mapping.txt --output koeken_out \
--class Treatment --split Day --level 6 --pval 0.05 --effect 2 --clade --image pdf

结果目录“koeken_out/lefse_output/run_lefse”里面，即为本次分析结果。

同前文LEfSe分析，对于统计结果文件，内容结构和LEfSe标准输出一致。

对于每个时间点的比较分析，各自输出一个统计结果文件。这也是Koeken的一个优势，允许一次同时并行分析多批次的数据，提高效率；同时各批次结果也能分开给出，便于我们各自比较。

第1列，每种微生物类群名称；“Other”没有自动去除，可手动过滤一下；

第2列，每种微生物类群在各分组类别中丰度平均值中最大值的log10（不过这不是原始丰度，而是标准化后的丰度，LEfSe自己有套标准化方法）；

第3列，若该微生物类群存在组间显著差异，且线性判别得分（LDA score）高于设定阈值，则该列展示其所富集的分组类别名称；若不存在显著差异，则该列为空；

第4列，若该微生物类群存在组间显著差异，且线性判别得分高于设定阈值，则该列展示其线性判别得分值，用以评估其对观测到的组间差异的效应大小，该值越高代表该微生物类群越重要；若不存在显著差异，则该列为空；

第5列，统计检验的p值，若显著，则将这些微生物作为解释类别之间差异的biomaker来看待；若不显著，则该列值为“-”。

使用该结果进一步作图，以图形方式展示了由分层要素名称指定的分类树中发现的biomaker，见“koeken_out/lefse_output/run_lefse/cladograms”。

图中每一个节点代表一种给定的微生物类群，对于不显著的微生物使用黄色节点标注，显著的则赋予其它颜色，颜色代表了其富集的分组，即表明这些分支在某些分组中具有更高的丰度。

不过由于上述结果表格没有自动过滤一些不重要的类群（如Other等），所以作图结果中的点很密集，很不好看。

此时不妨手动过滤一下上述结果表格，将其中的一部分不显著的微生物类群去除，之后再将编辑后的表读入LEfSe程序作图。如前文LEfSe教程所述，可以使用Galaxy云平台，也可使用本地版的LEfSe，过滤不重要数据后表格的出图效果应该会“整齐”很多。

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