微课回顾 | PCR-Free到底有啥“佛瑞”（附PPT）

上周智造微课第二期线上开讲，PCR-Free技术在DNBSEQ平台的应用表现大放异彩。其中到底有何玄机，本文将做简单介绍。

为什么需要PCR-Free技术

在高通量测序中，之所以引入PCR方法，是为了对微量DNA样本进行扩增，提高文库产量，放大DNA荧光信号，提高测序准确度。但是PCR在带来一些好处的同时，也会带来一些问题。例如，PCR聚合酶有一定的比例会引入错误，然后通过PCR, 这些引入的错误会持续累积下来，造成假阳性的变异，难以区分和识别。此外，PCR聚合酶具有一定的扩增偏向性，一些区域，尤其是高GC或者低GC，二级结构等区域，扩增效率低，难以覆盖到；还会引入大量错误的InDel；同时带来大量的Duplication，造成DNA数据量的浪费，增加测序成本。

因此，我们需要PCR-Free技术：既能具备PCR的优势，也能克服PCR的缺点，能够带来高质量的文库，不仅具备高灵敏度、能够实现微量样本的检测，而且具备高准确性、能够减少后续变异研究的验证工作量。

PCR-Free技术原理

基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术，在建库和测序过程中均没有PCR错误，将无扩增错误的PCR-Free单链环状文库建库方法与无拷贝错误累积的DNB制备方法结合起来，可以全面覆盖基因组的复杂区域，检测更精准，能够有效避免PCR扩增引入的碱基错配和偏向性。基于该技术，华大智造现已推出MGIEasy™ PCR-Free文库制备试剂套装（物理打断法）和MGIEasy™ 酶切PCR-Free文库制备试剂套装（酶切法），样本兼容性好，支持自动化建库（适配华大智造MGISP系列自动化平台）。

PCR-Free技术优势

基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术，经过自主研发和升级优化，其整体优势可以概括为低投入，高产出。

首先，在样本起始量方面，相较于其他平台PCR-Free方法的起始量要求，MGIEasy™ PCR-Free文库制备试剂套装（物理打断法）和MGIEasy™ 酶切PCR-Free文库制备试剂套装（酶切法）对起始量的要求都是最低的（50-1000ng之间），而且能够保证高质量的文库产出。

其次，基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术具备低InDel假阳/假阴率，高准确度的优势：基于MGISEQ-2000平台的PCR-Free ,可以实现99.9%的SNP检测精度及99%的InDel检测准确性。

最后，基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术具备低深度，高灵敏度的优势：在4X、6X、8X、10X测序深度下，基于DNBSEQ平台SNP的灵敏度更高。

PCR-Free数据展示

以发表在bioRxiv的预印文章Advanced Whole Genome Sequencing Using a Complete PCR-free Massively Parallel Sequencing (MPS) Workflow为参考，通过对比PCR-Free基于不同测序平台的数据表现（点击“阅读原文”可下载原文），结果显示：基于DNBSEQ 平台的MGIEasy™ PCR-Free数据相较于NovaSeq平台的MGIEasy™ PCR-Free数据及TruSeq™ DNA PCR-Free数据质量更优，尤其在Duplicate Rate以及InDel方面更具有显著优势。

文章同时对比了在15X及30X测序深度下，PCR与PCR-Free基于不同测序平台的数据，结果显示基于DNBSEQ平台的 15X PCR-Free测序数据与30X PCR-Free的结果一致，这一对比说明：全基因组测序要求大量的数据，大部分是因为测序错误高、重复序列高、覆盖度不均一等问题需要数据量来进行修复，这就提高了测序的成本。而通过DNBSEQ平台的低深度PCR-free文库就可以达到其他平台高深度PCR文库相同水准的测序结果，从而大大降低了成本。

PCR-Free应用方案

基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术，以其低投入、高产出的优势，在组学研究和临床应用的多个领域具有应用价值。

以群体基因组学研究为例，结合MGISP-960自动化建库仪以及DNBSEQ-T7测序仪，可以实现年通量一万人以上的高深度WGS检出。相较于其他方案，基于华大智造DNBSEQ平台的PCR-Free技术对人群样本的起始量要求更低。

针对动植物基因组学研究，基于DNBSEQ平台的PCR-Free方法的突出优势是对高低GC物种，无扩增偏好性。除了人类样本，动植物中存在很多不同GC含量的物种，至少40%的物种的基因组GC含量偏高或者偏低，例如褐潮藻类和小球藻，GC含量高达65%以上；线虫等不到30%。对于这些GC含量偏高或者偏低的基因组，常规的PCR技术存在明显的扩增偏好性，难以很好地覆盖基因组。而PCR-Free方法可以让不同GC含量的物种均具有较好的基因组覆盖均一性。同时，如果选择在DNBSEQ-T7测序平台展开该方案的应用，则兼备超高通量的成本优势和时间优势。

FAQ精选

Q1：高通量测序普遍都有Duplicate Rate 高的问题，如何看待这一问题？

A1：造成Duplicate Rate 高的原因有很多，包括样本本身的Duplication，以及PCR扩增导致的Duplication等。Duplicate Rate 高，主要是会造成测序通量和数据存储资源的浪费，增加了高通量测序的整体成本。基于原理优势，华大智造DNBSEQ平台在这一方面具备明显优势，Duplicate Rate低于3%。如果想了解更多关于Duplicate Rate内容，具体参见华大智造往期推文（点击直接转跳链接）

Q2：使用物理法与酶切法建库需要的最低投入量是多少？

A2：在保证gDNA质量和纯度的前提下，推荐酶切法最低投入量不少于50ng（Pooling测序），物理法最低投入量不少于200ng。

Q3：使用物理法和酶切法建库，两者的打断方式不同,其性能表现是否相同?

A3：使用物理法和酶切法建库变异检测性能表现无明显差异，均具有高准确度及高灵敏度。与机器学习变异分析软件（如：DeepVariant，DNAscope）相结合，可达到业界广泛认可的WGS金标准（SNP F-score >99.9%，InDel F-score>99%）。

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