程亦凡：从物理向生物领域的完美跨越

原创 2016-05-25 叶水送、郝俊 知识分子

►程亦凡。来源：hhmi.org

编者按：

5月24日，程亦凡应邀来到清华大学介绍自己的研究工作——冷冻电镜技术（cryo-EM）。冷冻电镜是继X射线晶体学和核磁共振技术之后，又一结构生物学研究利器。2016年初，英国学术杂志《自然·方法》在年度最受关注技术榜单中将其放在首位。

在冷冻电镜这场技术革命中，华人科学家功不可没。加利福尼亚大学旧金山分校程亦凡教授就是其中的代表。2013年，他解析近原子分辨率膜蛋白TRPV1结构，成为冷冻电镜领域的重大突破。这位自称曾是加利福尼亚大学旧金山分校年龄最大的初级教授，个人经历励志而感人。喜欢跑马拉松的他把研究也视作一场征途，坚持不懈而又脚踏实地追寻自己的目标。

撰文 | 叶水送、郝俊

责编 | 徐可

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2013年底，加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）、霍华德·休斯医学研究所（HHMI）程亦凡教授和其同事戴维·朱利叶斯（David Julius）教授合作，首次利用冷冻电镜技术解析近原子分辨率膜蛋白TRPV1结构，这是一种在疼痛和热知觉中起作用的膜蛋白。该研究一经发表，就引起巨大的轰动，甚至让部分蛋白质晶体学家感到职业恐慌。

在结构生物学领域取得巨大突破的程亦凡却是一名实实在在的物理博士。1978年，程亦凡入读武汉大学物理系，之后分别在武汉大学、中科院物理所拿到硕士以及博士学位。辗转于欧美以及日本多家研究机构后，直到2006年，他才算是在旧金山“安定”下来，成为加利福尼亚大学旧金山分校的一名初级教授，他大器晚成，但自言没有焦虑，而是一直享受学习新知识的过程。有关程亦凡教授的介绍，亦可参看北京大学讲席教授饶毅写的一篇文章“国产博士的记录”（点击文末“阅读原文”即可查看）。

5月24日，程亦凡应邀来到清华大学，作为结构生物学高精尖创新系列讲堂的演讲者，对清华大学生命科学学院的师生介绍了自己的研究工作。

在演讲中，程亦凡说，自己并非生物学科班出身的这一点，非但没有成为自身劣势，而是成为优势，正是凭着一股“无知者无畏”的勇气，他没有被常规思维所束缚，做出了突破性的发现。

邀请程亦凡来演讲的清华大学生命科学学院教授颜宁也说，让她最为佩服的是程亦凡不屈不挠的精神。

1为何从物理向生物领域转变

1987年，程亦凡刚读研究生时，国内第一篇准晶文章发表了，他很兴奋，“刚开始做研究生就看到这篇文章，我非常激动，决定学电镜，因为当时电镜是研究准晶最方便的一种手段。”彼时他在武汉大学跟随王仁卉老师，硕士毕业后他在中国科学院物理所李芳华实验室攻读博士学位，之后又来到了欧洲，辗转于挪威和德国。

然而1996年，程亦凡却面临着职业选择。他说，“做准晶十年后，就感觉有点枯燥了。我当时觉得生物这个领域比较有前途，所以我就转行到生物。”其实这也是历史机缘，程亦凡进一步解释道，1991年苏联解体，美国和西欧当时支持最大的一个科研计划——星球大战计划中止，全世界的物理学都在走下坡路。那时候最热门的纳米材料还没有起步，所以物理学家们都陷入了一种空前的危机中，很多人找不到工作，对他来说同样如此。很多做物理的人转去做材料，但他对材料兴趣不大，而对生物兴趣更大，因为生物更有挑战性。

程亦凡去了几个实验室学习，先后来到佛罗里达的肯·泰勒（Ken Taylor）实验室以及日本京都大学藤吉好则（Yoshinori Fujiyoshi）实验室。在日本，他学到很多膜蛋白知识，特别是冷冻电镜的使用。据他回忆，在藤吉实验室，他当时解析出来了一个脂膜的结构，解析到2.5埃（1埃=0.0001微米），不过该蛋白结构当时是已知的，所以论文一直没发表。1999年，他在哈佛医学院的汤姆·沃尔兹（Tom Walz）实验室，开始做单颗粒研究。2003年，他用电子晶体学做过一个水通道的膜蛋白，结构解析到1.9埃，到现在为止，这仍是（电子晶体学）最高分辨率的一个结构。

当然这种转变并非没有给程亦凡带来挑战。“我当时的想法还很幼稚，直到现在我觉得什么东西都学得会。”然而2006年，程亦凡自己开始建实验室时，面临的问题是，专业背景是物理，而不是生物化学，所以对如何长晶体是件容易的事，但把膜蛋白做成单颗粒却很困难，“我们也一直没有做这个东西。”

程亦凡从物理向生物的跨越，除了自己的努力之外，家庭强大的支持，也是他始终坚持自己兴趣的关键所在。“我太太很支持我，我们在全世界各地方转，她从来没有怨言，总是跟着我到处跑。有很多人放弃掉，很大一部分是家庭原因，他们希望稳定下来，找一份稳定的工作，对于我来说，这方面就没有想这么多。”

2013年，程亦凡在《自然》杂志发表膜蛋白TRPV1蛋白结构的论文，很多人认为来得很突然。但事实并非如此，其实程亦凡在这一领域已经积淀了很长时间，加上各项技术成熟，最终实现冷冻电镜领域的重大突破。

2“TRPV1的成功，并不偶然”

根据程亦凡介绍，2009年，程亦凡打算用FAB（抗体抗原结合片段）方法做膜蛋白研究，当时这还只是一个设想，没有任何现成的研究可以参考。于是他申请美国国立卫生研究院（NIH）的EUREKA基金，这个基金支持有独特想法的研究者，而无需申请者提出完整的研究计划。“我当时比较幸运，有了这个想法，就拿到了项目，于是就开始做起了膜蛋白研究。”程亦凡表示，朱利叶斯实验室2009年就已经用结晶的方法做TRPV1蛋白，但做了3年一直没有获得过晶体。“这在当时也是很多实验室碰到过的事情。于是我们就开始合作。”

与此同时，程亦凡对冷冻电镜技术非常感兴趣。加利福尼亚大学旧金山分校另一位资深教授戴维·阿加德（David Agard），上世纪90年代初就参与了第一代CCD（Charged Coupled Device，感光耦合组件）相机的研制，CCD相机可以把光信号转成数字信号进行成像，但它只能探测光而不能探测电子。程亦凡当时想将电信号转化成光信号，于是他就跟美国电镜公司Gatan进行合作，设计出第一台可用于电镜技术的CCD相机。数字相机的效率和限制比较多，信噪比在高频的时候非常差，低频时很不错，比传统底片要好。

程亦凡并非最早开始研究CCD相机，朱利叶斯此前也开始做直接探测相机，他想做电子计数相机，把相机的拍摄能力提高，能够识别单个的电子，进而更提高它的分辨率。虽然在当时这并不是很新的想法，但很多人认为这个想法不会实现。有好几个机构也在做这个相机，包括UCSF、英国医学研究理事会（MRC）以及加州大学戴维斯分校（UC Davis）等单位。而朱利叶斯是唯一一个始终在推动这个想法的学者。“我的工作主要是做相机的后期检测和应用开发，而戴维做前期设计。我们第一个把它用在比较小的单颗粒上面，所以当时这还是很激动的事情。”程亦凡表示。

事实上，在相机方面，2002年底至2003年初就有成效了。从2009年起，差不多3到4年的工夫就有了真正用的产品，于是很多技术问题已解决了，当时做TRPV1的结构已经做到3.3埃。“当文章出来的时候，很多人认为很快，几个月一下子就做出来了，实际上并不是这样。在TRPV1上，我们花了4年的功夫在相机方面，而戴维则把二十几年的功夫都花在这上面。所以说，这个工作的完成是天时地利人和的事情。”程亦凡表示。

►TRPV1蛋白的三维结构。来源：UCSF

3TRPV1的成功是技术及长时间积累的结晶

结构生物学里面三大技术：X光晶体学、冷冻电镜、核磁共振，冷冻电镜是这三条腿里面最弱的一条腿，因为它的分辨率一直提不上去。2013年，程亦凡的研究一出来，让很多研究者意识到冷冻电镜是一个更好的办法。“除了膜蛋白领域以外，这项工作改变了结构生物学的未来发展。在单颗粒的情况下，最好的时候可以做到5、6个埃，CCD相机出现以后，分辨率一下子就提高了。”程亦凡表示，“全世界很多实验室都做这个晶体结构，从1997年TRPV1的发现到2013年，15、6年间都没有得到结果。很多人把毕生精力和职业生涯都投入到这件事情上，从这个角度讲，对他们冲击力更大，也会让他们重新重视这个领域。”

“总体来说，TRPV1工作的成功，得益于三个方面：第一，相机的开发；第二， Relion程序的出现；第三，我觉得很多人忽视了这点，就是戴维实验室在生物化学方面的多年积累，这三个方面的事情结合起来是如此巧合。”程亦凡进一步表示。

从技术上讲主要是两个方面，一个是相机的突破，另一个是算法上的突破。

相机方面，当时有三家公司FEI、Gatan和DE同时在做。当时很多人都意识到，这个相机会对整个冷冻电镜产生革命性的影响，它用到了单电子计数（Single Electron Counting），可大大提高低频信号的信噪比，而且很多人认为这个相机真正的优势在于做很小的蛋白。“我做了好几年的膜蛋白，所以我第一个想到的是膜蛋白，而且膜蛋白也是最困难的一个TRPV1蛋白，”程亦凡表示。

另一方面就是计算方法上的突破，2000年左右的时候，耶鲁大学Fred Sigworth用最大似然（Maximum Likelihood）的办法来处理冷冻电镜的图像，但这个方法一直不是很成熟，后来英国MRC的科学家Sjors Scheres把Relion引进来，成立了自己的实验室。他最大的贡献是，把整个方法系统化，变成一个软件包，让不是很懂电镜的人也能用它。

电镜最大的问题是，要求蛋白非常纯，跟长晶体的要求是一样的，这是一个非常大的限制，最大似然法可能是最可靠的一种方法。“我们也是得益于他，做TRPV1的时候，用他的方法，很快就做到8埃了。”程亦凡谈到。他说，实际上，最大似然的方法也有很多年历史，英国MRC的Sjors Scheres教授第一次把这个方法拿出来时，也没有那么轰动，因为当数据质量不好的时候，它的功效是有限的，但是它同我们使用的K2相机结合在一起，就突然变得很强大。很多事情都发生在正确的时间和正确的地点上，如果说Scheres是三年前出来的，它可能也没有那么强大，因为图像质量不行。

4“不被教条束缚，而是去挑战它们”

TRPV1结构的解析以及相机的研发是程亦凡最自豪的工作之一。这两项工作的顺利完成，离不开实验室其他成员的支持。

解析TRPV1这项研究的第一作者廖茂富，目前在哈佛医学院做助理教授，“我很幸运他来我实验室，他来我们实验室之前，从没有做过电镜，也没有做过计算，因为他是生物学背景。”程亦凡当时有一个HIV gp40的项目，廖茂富一做就是六年，期间没有发任何文章，基本上要放弃，但他没有放弃过，而且还积累了很多经验。“当2009年至2010年，他开始接手做TRPV1时，当时也是很困难，什么都没有。但正因为他原来的经验，我们一步步做下去，等到某一个点，一下子有所突破，这不是个人的幸运，而是因为他有很多年的积累，才有最后水到渠成的感觉。”程亦凡欣慰地表示。

现任清华大学教授的李雪明也曾在程亦凡实验室待过四年左右，从头到尾一直参与相机的建立和应用程序的开发。“他是一名非常聪明的科学家，图像漂移校正技术的一个核心方面实际上就是他的一个想法，所以我们用相机的时候这也是水到渠成的一个做法。”程亦凡表示。回想这些年，程亦凡慨叹到，他们实验室不会被教条束缚，而是去挑战它们。朱利叶斯对他的评价是：不用理会教条，不理会什么是边界，因为总会有人挑战这种边界。

5UCSF历史上年龄最大的助理教授

程亦凡一直在坚持做自己喜欢的事情，但职业认可比较迟，他并没有放弃。北京大学讲席教授饶毅曾撰文称，“程亦凡到2006年才任助理教授，这时他的学术同龄人多半或是教授、或放弃学术生涯，一般人很难坚持这么久。”而程亦凡则认为，“我从来没有觉得自己比别人晚很得多，我一直觉得自己很幸运。我经常在学校里面跟人家开玩笑，我可能是UCSF历史上年纪最大的一个初级教授。”

2006年，当他在美国大学申请教职时，很多学校认为“你是物理学家，不懂生物学”，但UCSF的环境非常独特，“他们很赞赏我这种背景。当我到UCSF面试的时候，第一个问我的是我的前系主任。当我介绍，我是一个物理学家，系主任的第一句话是：That’s great, you know things we don’t know（这很好，你知道我们不知道的东西）。对方能看到个人的潜质，而且给我这种环境，始终没有给我任何压力。”程亦凡回忆到，2012年，当他拿到终身教授时，TRPV1工作还没有影子，虽然已经做了两年多，但什么都还没有做出来。这些都是他当时为什么选择UCSF的一个主要原因。然而国内却并不是这样，“很多青年学者很‘着急’。这是非常危险的，但具体很难说，这些学者的压力很大，因为国内的评价体系就是看文章，有文章什么都有了，没文章什么都很难，并不是考察你在某一个领域的洞察力。”

程亦凡经常跟学生说：“You can learn anything you want, the only question is how much you want to learn it”。正如他当年的经历那样，“1991年，我在材料物理领域做了五年的博士后，转行做生物时，我当时的计划是：重新读一个PhD，然后再做博士后，五年十年应该不算很长，因为你是在学一个新东西。如果你真想学，一定是可以学得会。我现在也是跟实验室的人说，廖茂富来的时候也没有做过冷冻电镜，也没有做过TRPV1，现在各方面都非常优秀，原因就是你可以学得会，只是你愿意花多大功夫，学到什么程度而已。”

当谈到这一领域还有哪些工作让他激动不已时，程亦凡笑着表示，“我感觉自己越来越像一个生物学家，我们实验室主要兴趣是在膜蛋白上，我想解决的问题并不只是解析出结构，而是希望能够理解生物机制，所以瞬时受体电位（TRP）通道一直是我们实验室的一个主要方向，另一方面，我们也希望从方法上能够获得更多提高，比如分辨率，希望能够提高到给制药公司做出很多东西，让他们觉得有用。我也希望能够把蛋白做到更小，比如100kD（千道尔顿，蛋白质质量单位）以下的蛋白，也能用电镜来做。”