七十年疑云渐去，自闭症研究前路何处？
前言：
自闭症患者往往生活在自己的世界里，不愿与别人交流。在这种异常复杂的精神疾病被发现至今的70多年间，科学家们从未放弃努力寻找根治它的良方。迄今的科学研究尚无法破解基因突变与自闭症的相互关系，但已经揭示神经发育及突触传导异常很可能是导致自闭症的重要因素。通过应用最新的基因工程技术，中国科学家在国际上首次建立携带人类自闭症基因MeCP2突变的转基因猴，为在非人灵长类动物模型中模拟人类自闭症，探讨发病原因并筛选改善和治疗自闭症的药物开启了新的窗口。
值得一提的是，科学研究发现，人类许多精神症状与基因关系密切，人类在研究自闭症的过程中也更深刻地认识了自身。那些生活在自己世界的孩子并不奇怪，他们，不过是人作为一个整体在不同世界的显现。
文 | 仇子龙（中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所）
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1940年代，美国医生卡纳（L. Kanner）发现一类奇怪的孩子，他们仿佛只活在自己的世界中，不愿与别人交流。这些孩子往往有一些重复刻板的动作，不太说话或者语言模式古怪，缺乏沟通和语言交流。他给这种病起了一个名字：自闭症（autism）。在距离自闭症被发现后的半个多世纪中，医生还发现自闭症儿童除了具有卡纳医生发现的经典症状外，其中少数人具有超强的机械记忆力，或者在数学、音乐等方面有特殊才能。
近年来，随着社会大众对自闭症的不断关注，大量国内外描写自闭症的影视作品纷纷出现，让人们对这种神秘的疾病充满了好奇。自闭症究竟是什么原因导致的？目前自闭症的发病率究竟有多少？能否治愈？随着医学与科学的发展，临床医生与科学家紧密合作，已对自闭症的起因与发展有了一些了解。科学家发现，人类许多精神症状与基因关系密切，人类在研究自闭症的过程中也更深刻地认识了自身。
致病原因：先天遗传还是后天因素？
最早研究自闭症的时候，卡纳医生认为这种病可能是父母对孩子的过分冷漠而导致的。这样，完全由后天因素导致自闭症的观点流行了很长时间。一直到研究者发现，如果一个孩子患有自闭症，家庭中其他孩子也是自闭症患者的概率大大上升，并且家族中出现自闭症患者，家族内其他成员罹患自闭症的概率也大大上升。这些说明自闭症具有比较明确的家族遗传模式，提示自闭症与遗传因素密切相关。
疫苗疑云与遗传之谜
1998年，著名国际医学学术期刊《柳叶刀》（Lancet）发表了一篇报道，英国韦克菲尔德（A. Wakefield） 医生发现，8位儿童在接种了麻疹、腮腺炎和风疹疫苗（MMR）后一个月内开始出现了自闭症症状，因而怀疑MMR疫苗接种有可能导致自闭症。这项研究掀起了一场轩然大波，无数家长担心孩子安全而不敢给孩子接种MMR疫苗。
在之后的十余年中，疫苗与自闭症的关系始终扑朔迷离。2010年2月，因为发表的数据存在很大问题，《柳叶刀》杂志宣布撤销了这篇引起很大争议的文章。美国疾病控制与预防中心在2011—2013年接着发布了一系列研究结果，通过大规模的数据分析及实验证明，8种用于小儿免疫接种的主要疫苗十分安全，不会导致自闭症。
1998年的报道暗示接种疫苗可能导致发生自闭症，尽管官方已出具权威报告，但民众始终很难完全放心。让我们回顾一下这些病例，现在已知自闭症与遗传因素密切相关，因此是否可能这8个自闭症患儿本身的基因有易感性，而疫苗接种起到了引发作用？如果是这样，那么疫苗接种引发的机体免疫反应与自闭症的发展又是什么关系？与免疫反应相关的基因突变是否可能与自闭症有关？随着科学研究的进展，这些未解之谜慢慢被揭开。
首先，必须寻找导致自闭症的罪魁祸首——遗传因素。科学家从20世纪最后十年开始了寻找自闭症易感基因的竞赛。有趣的是，遗传性疾病与基因突变的关系也在对自闭症的研究中得到重新认识。
传统的观点认为，遗传性疾病往往可以找到少数几种明确的致病基因，比如镰刀型贫血症往往由编码血红蛋白的基因发生突变所致，各种癌症也往往与癌基因的突变紧密相关。
当研究者在收集成百上千例自闭症患者及直系亲属的遗传样本后，运用经典的基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）方法，却极少能找到自闭症患者中出现明确的致病基因，而且发现自闭症患者中发生的遗传突变往往因人而异，各人之间很少有共同的致病基因，基因组关联分析法在寻找自闭症致病基因的过程中陷入了困境。
恰恰在这个时刻，一场生物学革命的悄悄到来，给自闭症致病基因的筛查带来了希望。
人类基因组计划
人类基因组终于在世界各国科学家共同努力下，在20世纪最后10年被成功破译，组成人类基因组的30亿个碱基被测序完成，这个庞大的项目被称作人类基因组计划（Human Genome Project）。人类终于可以对自己的遗传信息有全面的认识。当初并没有人预到，十几年前需要天价才能完成的基因测序，由于测序技术的飞速发展，目前的价格已下降到令人咋舌的地步：在20世纪需要世界各国科学家花费30亿美元、耗时10年时间得到的人类基因组全序列，在21世纪的今天，用最新的测序机器，可以在几周之内、以低于1万元人民币的价格完成！
在基因组测序已经变成检测基因突变的日常手段的时候，该如何寻找自闭症的致病基因呢？目前的基因组测序比较常用的方法包括获取基因组全部信息的全基因组测序（Whole-genome sequencing，WGS）和获取编码蛋白外显子组全部信息的全外显子测序（whole-exome sequencing，WES）。由于测序准确、价格便宜，全外显子测序成为科学家寻找遗传疾病致病基因普遍采用的一种方式。
在过去5年中，尤其是在2014年，一系列通过收集上千例自闭症病例的研究，利用全外显子测序等方式全面寻找了自闭症可能的致病基因，找到的相关基因突变约100多个。这100多个基因的突变是如何导致自闭症的？
神经科学研究
既然遗传学无法破解基因突变与自闭症的相互关系，那么可否借助神经科学的研究，来确定某种基因的突变究竟是否会导致自闭症。
自闭症是一种精神疾病，同属于精神疾病范畴的还包括精神分裂症、双向情感障碍及抑郁症等。精神疾病不同于神经退行性疾病，如阿尔茨海默症（又称老年痴呆症）与帕金森症等等，并没有明显的神经元病变。面对精神疾病患者，往往需要核磁共振等脑成像工具来对大脑进行无创伤的研究。而自闭症患者往往是少年儿童，他们往往很难与人正常沟通，不易采集高质量的脑成像。因此世界各国对于自闭症的脑成像研究一直进展缓慢。
对神经生物学家来说，首先要解决的问题是，究竟这些在自闭症病人中发生突变的基因对神经系统有哪些重要的功能？科学家在对自闭症的遗传分析中发现，许多突触蛋白的编码基因发生了突变。突触（synapse）是大脑的基本组成单元，是神经细胞之间进行通讯的基本单位。突触中有许多蛋白质有重要功能，突触本身具有可塑性，即对突触进行一系列的刺激后，突触会更容易被激活或更容易被抑制。这种可塑性很可能是大脑进行学习记忆和情绪反应等认知功能的神经生物学基础。
找到了与神经细胞突触传导功能关系密切的基因后，需要探究其发生突变后所产生的结果。首先，在自闭症患者中这些基因突变是否影响其编码蛋白的正常功能。其次，运用基因工程方法，在模式动物（例如啮齿类或非人灵长类）中引入自闭症相关的基因突变。在含有同样基因突变的动物模型中，观察是否有可能出现类似孤独症的症状。神经科学研究者在过去10年中对这两大问题进行了深入研究。
突触蛋白与自闭症
在自闭症患者身上发现的一大类基因突变都发生在一些在突触中起粘联功能的蛋白的编码基因中，这类突触粘联蛋白负责把突触连接起来。这个家族蛋白中的neuroligin蛋白位于突触的接收端，而neurexin蛋白位于突触的信号发放端，它们相互作用使神经细胞间得以进行正常的信号传递。
neurexin蛋白和neuroligin蛋白于1992—1995年间被聚德霍夫（T. Südhof）教授用生物化学的方法纯化出来。在自闭症中的遗传筛选分析大多都是如此，找到很多在自闭症患者身上发生突变的基因都是以前被发现有重要功能的蛋白编码基因。当它们被发现在自闭症患者中有突变的时候，研究者才意识到它们的重要性。
聚德霍夫在得知neuroligin-neurexin家族蛋白的编码基因在自闭症患者中发生突变后，立即进行了大量研究工作，其中最著名的研究即是2007年将在自闭症患者中找到的一个基因突变 neuoroligin3 R451C移植到小鼠中，将小鼠的同源基因neuroligin3也在同样位点做了基因突变，这个携带有与人类自闭症相同突变的小鼠居然表现出与人类自闭症患者非常相似的表型，表现出重复刻板的行为和不愿意与同伴小鼠进行交往等行为。
深入的研究发现，携带neuroligin3 R451C突变的小鼠大脑中，抑制性突触比正常小鼠的多，功能更强。这项研究首次成功地在小鼠中显示了人类自闭症的表型，也提示可以用基因工程的方法，在动物模型中模拟人类自闭症，探讨发病原因，并筛选改善和治疗自闭症的药物。
基因的过犹不及
在自闭症的遗传学研究中，除导致突触蛋白结构变化的编码基因突变外，近年来还发现有另外一类的基因突变，表现为一段染色体区域的倍增或缺失，即拷贝数变异（copy number variations）。拷贝数变异也是在完成了人类基因组测序之后才被发现的。染色体区段的缺失往往导致基因的丢失，而染色体区段的倍增则会导致基因过多。原来除了基因突变导致蛋白质丧失功能，居然某些基因过多也会导致对神经系统的破坏。
2009年医生和科学家发现，在一些严重自闭症症患者中，一个甲基化DNA结合蛋白MeCP2 （methyl CpG-binding protein 2）的编码基因出现拷贝数的倍增。MeCP2是一个甲基化DNA结合蛋白，具有调控基因表达的重要功能。
1999年佐格比（H. Zoghbi）教授发现一种严重的神经发育性疾病——瑞特综合征（Rett syndrome）也与MeCP2基因突变密切相关，95%的瑞特综合征患者携带的MeCP2基因发生缺失功能的突变。瑞特综合征患者因为有部分与自闭症患者类似的表型，早期也被归为自闭症谱系障碍的一种（autism spectrum disorders）。因此这些证据表明，基因表达的表观遗传学调控与神经系统的发育与功能密切相关，如果失调可能导致神经发育性疾病，例如自闭症等。
经过数年的深入研究，科学家发现MeCP2蛋白质确实对神经元的突触功能有重要影响。接下来，研究者陆续制作了多种MeCP2基因敲除与转基因的小鼠模型，来观察如果小鼠携带有过多的MeCP2蛋白，是否能表现出类似自闭症的表型。
2006年佐格比研究组将人MeCP2基因转入小鼠后，惊奇地发现携带人类MeCP2基因的转基因小鼠表现出焦虑水平上升和社会交往行为缺陷等类自闭症表型。这个小鼠模型极大地推动了自闭症的研究。人们可以研究过多的MeCP2蛋白究竟如何影响大脑发育，更重要的是，这个模型是否能告诉我们含有自闭症基因突变的哺乳类大脑在发生社交障碍的时候，大脑里究竟发生了什么。
免疫导致的自闭症动物模型
2007年帕特森（P.Patterson）教授研究组发现，用给怀孕母鼠注射白介素6（IL6）的方法可以诱导子代小鼠出现明显的类自闭症与精神分裂症表型，这种方法被称为母源免疫激活（maternal immune activation，MIA）。研究者发现，在MIA诱导的类自闭症小鼠模型中出现了代谢系统紊乱，而改善代谢紊乱的药物居然可显著改善MIA小鼠模型的自闭症表型。
这些研究结果令人振奋，但是同时必须认识到，自闭症的起因多种多样，用MIA方法诱导的模型是否能够完全模拟人类自闭症还需深入研究。例如需要将MIA模型与其他自闭症基因突变小鼠进行仔细比较，并研究在MIA模型中出现的代谢异常等现象是否在其他自闭症小鼠模型中也会出现。
该项研究不禁让我们回想起当年的小儿疫苗疑云，难道免疫系统的异常与因神经系统功能异常而产生的自闭症有相关性吗？我们必须认真看待这个问题，因为免疫系统与神经系统的相互作用近年来被逐渐关注。还不能定论免疫系统的缺损与异常是否一定会导致自闭症，但是对于这个前沿领域的深入研究必然让我们对机体中两大系统如何相互作用的机理有更深刻的了解。
更接近人类的自闭症动物模型
虽然在小鼠中引入与人类自闭症相关的突变，进而研究自闭症基因突变如何影响大脑发育已经有很多重要发现，但是，人们始终疑惑的是，像自闭症这种复杂的精神疾病，能否用啮齿类来准确模拟呢？能否确定小鼠的类自闭症状是否与人类的自闭症足够相像呢？
更重要的是，人类的大脑沟回很多，整体大脑的体积与复杂程度，是啮齿类动物的大脑完全无法比拟的。目前在小鼠中尝试成功的一些神经疾病药物结果，在人类病患身上的临床试验很少获得成功。因此，是否可以用进化上与人类尽可能相近的生物来构建自闭症动物模型还是一个问题。
从2013年开始兴起的基因工程技术为直接操作与人类亲缘最近的动物——非人灵长类（猴类）提供了巨大便利。2014年，中国科学家陆续报道了一系列利用非人灵长类制作疾病动物模型的工作，包括瑞特综合征与帕金森症等。2016年1月，中国科学家报道首次将自闭症相关的MeCP2基因成功转入猴子基因组，并在携带MeCP2基因的猴子上观察到了数种与人类自闭症病人非常相似的表现，因此得到了自闭症的非人灵长类模型。
有了这些携带人类疾病基因的灵长类模型，就有可能在更接近人类的动物系统中研究这些基因突变怎样改变灵长类动物大脑，进而获得更接近人类的药物筛选系统。
自闭症研究的未来
自闭症是一种异常复杂的精神疾病，对医学与神经科学研究提出了巨大挑战。自闭症研究让我们认识到，人类的复杂社交行为有可能是通过精妙的神经环路来调控的。因此对自闭症的科学研究，将为深入认识人类社交行为的神经环路基础提供重要线索。
得益于DNA测序技术的飞速进步，未来对自闭症的遗传分析可以更加深入和全面，可以揭示以前无法找到的基因突变与染色体结构变异。在对疾病基因的神经生物学研究方面，科学家也将积累更多的数据，有助于对某些基因突变是否与疾病相关的判断。笔者相信神经科学在自闭症动物模型中的研究，在不远的将来，定会帮助我们找到基因突变如何导致自闭症的机理和有效的干预方法。
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本文原载于《科学》杂志，原题为《自闭症的神经生物学研究》，《知识分子》获作者授权发表，略有修订。
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