基础时间：B1*应力刺激对骨质疏松性骨折和雌激素受体表达的影响
导读
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今天给大家带来的是2016年发表在《Osteoporosis International》（IF=3.445）上的一篇基础研究成果，作者是来自香港中文大学的W.H.Cheung团队，题目是“Mechanical stimulation enhanced estrogen receptor expression and callus formation in diaphyseal long bone fracture healing in ovariectomy-induced osteoporotic rats”，主要证明了应力刺激（采用的是全身振动治疗）可以提高卵巢切除诱导的骨质疏松大鼠雌激素受体表达和长骨骨干骨折骨痂形成。
背景知识
骨质疏松性骨折（osteoporoticfracture）：骨质疏松症最严重的并发症，由于骨质疏松引起的骨折严重威胁老年人的身心健康并影响老年人的生活质量，其致残率、致死率以及医疗护理费用均十分高，其重要性仅次于心脑血管疾病。在骨质疏松性骨折中，脊柱骨折、髋部骨折和桡骨远端骨折最为常见。
全身振动治疗（whole-body vibration treatment）：一种物理因子治疗手段，属于振动疗法中的一种，指借助振动仪器，使振动刺激通过下肢或躯干作用于全身，使机体整体振动，起到类似于身体运动的作用。
雌激素受体（estrogen recptor(ER) ）: 包括两大类：一是经典的核受体，包括和ERβ ，它们位于细胞核内，介导雌激素的基因型效应，即通过调节特异性靶基因的转录而发挥“基因型”调节效应；二是膜性受体，包括经典核受体的膜性成分以及属于G 蛋白偶联受体家族的GPER1( GPR30)、Gaq-ER和ER-X，它们介导快速的非基因型效应，通过第二信使系统发挥间接的转录调控功能，其中一些似乎只在脑局部起作用。这两类受体在机体内的分布具有组织/ 细胞特异性，参与了对诸如生殖、学习、记忆、认知等多种功能的调节。
骨痂（callus）：是指骨头受伤后愈合过程中形成的痂。一般将骨折愈合分为 3个阶段，即血肿机化期、原始骨痂形成期和骨痂改造塑形期;也有根据骨折愈合过程的组织学和生理学特征分为撞击期、诱导期、炎症期、软骨痂期、硬骨痂期和改建期 6 个不同的阶段。多种骨生长因子与骨折愈合有关，它们共同作用可刺激成骨细胞的活性，调节局部成骨。
文章解读
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研究目的
探索雌激素受体（ER）在力学信号传导和全身振动治疗提高骨质疏松性骨折愈合中所扮演的角色。
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研究思路
作者分别在动物水平和细胞水平进行论证，研究方案如下图所示：
动物实验分组：
SHAM:假手术组；SHAM-VT:假手术+全身振动治疗组；OVX:卵巢切除手术组；OVX-VT: 卵巢切除术+全身振动治疗组；OVX-VT-ICI：卵巢切除术+全身振动治疗+ER抑制剂ICI皮下注射组
细胞实验分组：
CTRL+E2:对照+雌激素组；VT+E2:振动+雌激素组；CTRL:对照组；VT:振动组；VT+ICI组：振动+ER抑制剂ICI组；
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涉及的实验技术
动物造模：卵巢切除诱导的骨质疏松大鼠模型，然后造成闭合性股骨骨干骨折。
ER抑制：采用氟维司群ICI 182，780抑制ER的表达。
全身振动治疗（VT）：采用定制的垂直振荡平台，频率35Hz，标准能够提供最大的峰加速度为3×g(g是重力加速度=9.8m/s2)，在骨折后第5天开始治疗，每次治疗20min，5天/周，总共治疗8周，细胞实验是把培养皿放在平台顶部。
Micro-CT: 微型CT观察测量骨痂形态，测定低密度骨量分数（LD-BV/TV）来反应骨痂形成。
RT-PCR：检测骨痂中ERα、I型胶原（Col-1）COL1、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的mRNA表达，Col-1和BMP-2判断骨形成的关键指标。
免疫组化：检测骨折的股骨中ERα的蛋白表达。
细胞培养：取大鼠头盖骨，体外培养成骨细胞，进行不同的干预分组，研究成骨细胞。
碱性磷酸酶（ALP）活性分析：检测成骨细胞分化情况。
钙结节形成分析：量化原代成骨细胞矿化情况。
统计学分析方法：均值+标准差；单因素方差分析-Bonferroni检验。
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研究结果
动物实验：
（2）Fig 1是Micro-CT影像学评估的图片，图A可以看到骨折部位的骨痂，图B是选择感兴趣的区域明确组织含量（TV），图C是用红色标注的新形成的骨痂。
（3）Fig 2是各实验组2~8周骨痂宽度（CW）和面积（CA）的测量结果，图A数据表明，SHAM, SHAM-VT和 OVX-VT组骨痂宽度在2-4周是高的，在第8周是低的；图B数据表明，与OVX、OVX-VT-ICI组相比，SHAM, SHAM-VT和 OVX-VT组骨痂面积在2-4周，5-7周是高的。证明了全身振动治疗可以显著促进骨折后骨痂形成。
（4） Fig 3图A是每个组第2周、第4周、第8周有新骨痂形成的骨折部位3D重建的Micro-CT影像图，图B是LD-BV/TV的测定结果, 结果证明了全身振动治疗在骨折早期2-4周可以显著提高LD-BV/TV，促进骨痂形成，而ER抑制剂在会抑制全身振动治疗在2-4周的治疗效果，而在8周有促进作用。
（5） Fig 4是免疫组化检测的ERα表达结果，数据主要证明了全身振动治疗在骨折后治疗2周、4周可以提高ERα的表达，而治疗8周会降低ERα的表达，这种效果会被ER抑制剂ICI阻断。
（6） Table2是第2、4、8周每个组ERα、Col-1和BMP-2的基因表达情况。数据证明骨质疏松大鼠与假手术大鼠相比ERα表达是下降的，全身振动治疗在骨质疏松性骨折2周可以提高ERα的基因表达，而在4周以后这种效果是下降的。同时骨质疏松大鼠与假手术大鼠相比Col-1表达也是下降的，全身振动治疗在骨折2-4周可以显著提高骨质疏松大鼠Col-1的基因表达，而ER抑制剂会阻断全身振动治疗的作用。结果还显示，全身振动治疗在骨折后4周可以显著提高骨质疏松大鼠BMP-2的基因表达，在第8周，骨质疏松大鼠BMP-2表达与假手术大鼠相比是增高的，ER抑制剂会BMP-2的基因表达。
细胞实验结果：
（1） Fig5 图A是RT-PCR检测的各组成骨细胞的ERα基因表达结果，数据证明了全身振动治疗联合雌激素可以提高体外培养的成骨细胞中ER的表达，但单独的全身振动治疗并不能提高ER的表达。
（2） Fig5 图B是成骨细胞ALP活性分析测定结果，数据证明全身振动治疗联合雌激素相比单独的雌激素干预可以提高原代成骨细胞分化，单独的全身振动治疗可以显著提高成骨细胞分化，而ER抑制剂ICI会明显阻断全身振动治疗的效果。
（3） Fig5 图C是成骨细胞钙结节形成分析结果，数据证明全身振动治疗联合雌激素干预与单独雌激素干预相比无显著差异，单独的全身振动治疗与对照组相比也无显著差异，但单独的雌激素干预与对照组相比有显著差异，全身振动治疗+ER抑制剂干预与对照组和单独的全身振动治疗相比都无显著差异。
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讨论
通过以上数据，作者得出结论：全身振动治疗可促进骨质疏松性大鼠骨折愈合，这个治疗效果是基于ER表达提高的情况下。作者认为全身振动治疗导致的ER表达提高可能跟成骨细胞没有相关性，而可能跟通过血流增加和血管形成导致有ER表达的祖细胞募集增多有关。作者同时也指出这个研究的缺陷是动物模型只有股骨骨折，而且只研究了成骨细胞这一种骨细胞，并不能确定力学刺激导致的ER增高与哪种细胞有关。
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