【好文共赏】宏基因组实验的那些坑-16S扩增子建库方法的各影响因素

微微碎碎念：关于扩增子建库方法，小编之前牢骚了很多篇了~为啥？因为实在太多的坑了！！！

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可谓是实验过程处处坑啊

如果说之前分享的几篇文章，因为样本数等诸多遗憾，结论还不够坚实，那么刚发表于Microbiome，影响因子高达8.4的这篇文章，说服力应该是足够的了~ 与诸君攫取精华分享

参考文献：Muinck E J D, Trosvik P, Gilfillan G D, et al. A novel ultra high-throughput 16S rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the Illumina HiSeq platform[J]. Microbiome, 2017, 5(1):68.

文章主题：利用模拟样本和真实样本，评估不同因素对16S扩增子测序的影响。

模拟样本中含有等浓度的33种细菌的16S全长序列的构造质粒。

评估的因素包括：

（1）DNA提取方法

（2）样本浓度

（3）PCR第一轮引物

（4）PCR第二轮引物

（5）PCR循环数

（6）目标菌的GC含量

（7）Miseq vs Hiseq

一句话结论：以上因素皆影响测序结果。。。。。。

如主成分分析图所示： 不同的扩增引物（不同颜色标注）有明显差别

又如GC图所示，模拟样本中GC含量越低的目标菌检测出来的丰度越高。

再如下图，样本浓度的高低（三角符号和圆点符号）及PCR循环数的不同（不同颜色）结果皆有明显区别

PCR循环数越多，结果中嵌合体比例越高

更多细节，可点解“原文链接”了解

微微碎碎念：为啥小编总是念叨着标准化、标准化呢？因为宏基因组研究的实验中有真的有这么多坑啊~~~ 

试想一下，有这么多因素影响实验结果，假如我们没有标准化的实验方案的话，我们如何确保我们结果的可比性和可靠性？假如不重视这些看似不起眼的技术环节，先不提研究结果转换为临床的检测方法了，也不说研究结果为他人所借鉴了，连自己组内的实验重复都有问题啊。

宏基因组技术发展至今，研究者已经不缺数据了，网上有大把的数据可供下载。可是这些数据大家敢用吗？不敢啊~因为压根不了解这些数据产生的方法和技术细节，就没法把这些数据和自己的结果比对。

没有办法为他人所用的数据，甚至没有办法为自己二次所用的数据，价值何在？？ 

希望大家共同思考，咱们怎么能打破这一难关？ 共勉之~