近日，重庆大学罗阳教授团队以后封面的形式在《Analyst》上发表了题为“Probing low abundant DNA methylation by CRISPR-Cas12a-assisted cascade exponential amplification”的文章。文章中构建了一种基于RCA及CRISPR/Cas12a辅助的三重循环级联信号放大的DNA甲基化检测方法（CAM）。在后封面图中以“蝴蝶效应”为喻，表明即使起始条件（DNA甲基化）仅发生微小变化（低丰度靶标），亦可通过“三重循环放大”来引起巨大的连锁改变（信号扩增）。该方法可以实现准确、灵敏地识别异常DNA甲基化，有望为癌症早期诊断提供新的思路。
甲基化是表观遗传学中研究最广和最重要的部分，DNA甲基化发生在由DNA甲基转移酶催化的CpG二核苷酸中胞嘧啶的C-5上。CpG岛出现在启动子区域内的转录起始位点并调节基因表达，当该区域发生甲基化异常时，可导致肿瘤抑制基因失活、控制细胞周期和生长的调节区域失调，或降低对治疗的反应。由于可以在多种体液样本中都可以检测到DNA甲基化的变化，因此，基于DNA甲基化的检测技术构建为癌症的无创早期诊断带来了希望。
第一作者：张亮亮、赵贤贤
通讯作者：罗阳、张洪
作者首先利用亚硫酸氢盐处理待测序列，当经过亚硫酸氢盐处理后的甲基化DNA可以在与所设计的Padlock完全互补时形成不完全闭合的环状结构。在酶的作用下触发RCA反应（第一重信号放大），而非甲基化DNA在被亚硫酸氢盐处理后碱基发生变化而无法与Padlock完全互补触发后续反应。
随后，引入内切酶Nb.BbvCl利用它特异性识别和切割能力，切割释放目标序列启动第二重信号放大。RCA扩增的产物可以在crRNA引导下激活Cas12a蛋白的反式切割活性（第三重信号放大）。在体系内设计了两端分别标记FAM与BHQ基团的ssDNA（报告探针），当CRISPR/Cas12a被激活后可以切割报告探针，产生能够被测量的荧光信号。
图1 本研究的工作原理（a）整个反应程序，包括亚硫酸氢盐对靶序列的转化及信号放大部分；（b）处理后的甲基化DNA进行三重信号放大流程，具体包括 ⅰ）RCA扩增，ⅱ）Nb.BbvCI切割靶标进行再次RCA扩增，ⅲ）CRISPR/Cas12a 的反式切割及信号读取
作者对CAM用于DNA甲基化检测的可行性进行了验证。图2a表明在该策略中被亚硫酸氢盐处理甲基化DNA仍能触发后续的RCA扩增。透射电镜结果中呈现不规律的线状结构（图2b），也证明了RCA扩增产物的存在。图2c证明该策略可行，并成功触发CRISPR/Cas12a的反式切割活性切割报告探针。荧光结果也表明了（图2d），只有甲基化DNA能够触发荧光的信号产生（荧光强度为1178.67±30.24 a.u.），并且在加入Nb.BbvCI酶组荧光强度急剧增加（曲线3）至2148.67±46.52 a.u.。上述结果表明，CAM可以成功实现DNA甲基化的测定。
图2 可行性验证（a）PAGE验证亚硫酸氢盐处理后的甲基化、非甲基化DNA扩增能力；（b）RCA产物TEM表征；（c）PAGE验证可行性；（d）荧光验证可行性
高灵敏度的检测方法对于甲基化异常相关疾病的早期诊断至关重要。为了评估所提出的CAM的灵敏度，作者研究了荧光强度随甲基化DNA浓度的变化。如图3a所示，从1 fM到100 pM之间具有良好的线性关系（图3b），检测限达到342 aM。随后对模拟样本进行检测，可以从模拟样本中检测到低至0.01%甲基化DNA（图3c），此外，为了进一步确认CAM分析对特异性甲基化的鉴别能力，作者使用了几种干扰因素并通过CAM对其进行检测。结果显示（图3d）该方法具有较强的特异性。
图3 性能评估（a）灵敏度；（b）标准曲线；（c）模拟样本验证；（d）特异性
综上所述，在整合RCA及CRISPR/Cas12a系统检测体系的基础上，引入内切酶Nb.BbvCI，通过识别扩增出来的序列位点切割释放目标序列来触发级联指数扩增。该方案具有很高的灵敏度，甚至可以从混合物中区分低至0.01%的甲基化水平。
通讯作者简介
罗阳
重庆大学医学院教授，公共实验中心主任，国家杰出青年科学基金获得者，国家特支计划青年拔尖人才，重庆市五四青年奖章获得者。先后获国家科技进步二等奖、重庆市技术发明一等奖、重庆市产学研创成果一等奖、“十一五”军队医学科技重大成果奖、军队科技进步二等奖等省部级以上奖项10余项。
主要研究方向为疾病早期监测预警，主要包括POCT血型快速检测、CRISPR-Cas系统超敏检测技术、胞外囊泡（EVs）高效分离与原位检测技术以及新型纳米医学诊断技术。在Sci Transl Med，Nat Commun，ACS Nano，Adv Funct Mater，Trends Biotechnol，J Am Chem Soc 等CNS子刊和顶刊发表高水平学术论文50余篇。申报国际PCT专利6项，获国家发明专利授权20余件。
张洪
博士，长期围绕生物分子快速检测开展研究，作为项目骨干参与国防科技创新特区项目、国家自然科学基金、重庆市杰出青年基金等多项省部级以上课题；相关研究以第一作者在Science Translational Medicine (16.71，封面论文)，ACS Nano (15.881)等顶级期刊发表；申报发明专利5件，已授权2件，申报国际PCT专利1件；曾获全军优秀硕士论文、中国国际互联网+创新创业大赛重庆市金奖（2项）、国家奖学金等奖项6项。任中国医疗器械行业协会现场快速检测分会常务委员，世界华人检验与病理医师协会委员等社会职务。
参考文献：
Liangliang Zhang#, Xianxian Zhao#,Xiaolin Hu, Yi Zhang, Ruining Liu, Hai Peng, Hong Zhang*, Yang Luo*, ProbingLow Abundant DNA Methylation by CRISPR-Cas12a-assisted Cascade ExponentialAmplification. [J] Analyst. 2022. (IF: 4.616) Back Outside Cover. DOI:10.1039/D2AN00170E
原文链接：
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/an/d2an00170e
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