灯盏生脉胶囊化合物全面表征和鉴定的二维液相色谱质谱分离分析新策略
灯盏生脉胶囊是目前唯一具有A级循证医学依据的脑卒中二级预防中药，临床主要用于缺血性心脑血管疾病的恢复期治疗。由4种中药材组成，分别是灯盏细辛、人参、麦冬和五味子，已报道的主要成分包括有机酸类、黄酮类、皂苷类和木脂素类成分（见图1）。进行灯盏生脉中各类成分的全面表征和鉴定是本研究的重点，为其作用物质基础和作用机制的深入研究提供信息。
由于中药复方的成分复杂，化合物结构种类多、成分含量动态范围宽、化合物数量多，同时全面表征和鉴定中药复方的成分面临挑战，近年来多维色谱结合高分辨质谱技术进行中药成分的分析和鉴定发展很快，采用多维色谱联用高分辨质谱技术能够更加高效的识别和鉴定大量化合物，已经成为中药复杂成分分析的有力手段。基于此，本研究探索了基于全二维液相色谱质谱技术(LC×LC-qTOF-MS)和多中心切割二维色谱质谱技术(MHC-qTOF-MS)的灯盏生脉中化合物全面表征和鉴定的新策略，同时解决了同分异构体分离的问题。
全二维液相色谱质谱技术(LC×LC-qTOF-MS)将不同模式的液相色谱（RPLC、NPLC、HILIC、IEC、SEC、SFC）进行组合，获得高正交性和高峰容量，实现对复杂成分的高效分离，联用四极杆飞行时间质谱的技术，能够实现对化合物的快速鉴定，适用于复杂体系的成分分析和鉴定。多中心切割二维色谱质谱技术(MHC-qTOF-MS)可对第一维色谱中的色谱峰进行连续切割，分别收集后进行第二维分析，与全二维液相色谱质谱技术联合应用，可进一步针对性解决分离难点和提高色谱分析能力。
图1 灯盏生脉中的中药和主要类别化合物
采用安捷伦1290和1260 UHPLC液相色谱与安捷伦QTOF 6550 MS联用仪，建立了基于全二维液相色谱联用四极杆飞行时间质谱 (LC×LC-qTOF-MS)系统（C8×C18）对灯盏生脉胶囊中的化合物进行全面表征的新策略；针对存在的同分异构体包括手性异构体等，探索了基于多中心切割二维色谱四极杆飞行时间质谱联用(MHC-qTOF-MS)系统（C8×Chiral）分离模式，首次将反相分离和手性分离色谱柱相结合，完成了灯盏生脉中部分同分异构体包括手性异构体化合物的分离。具体策略如下（策略流程图见图2）：
1.基于TCMID中药化合物数据库(http://www.megabionet.org/tcmid/search/)，收集整理了灯盏生脉中灯盏细辛、人参、麦冬和五味子的各类化合物信息包括Ingredient Name，Molecular Formula，Pubchem ID，Source；建立了灯盏生脉Personal Compound Database and Library （PCDL）化合物数据库，共有537个化合物；
2.优化了全二维色谱和质谱条件，建立了灯盏生脉全二维LC×LC-qTOF-MS分析系统，采集了色谱和质谱分析数据，通过Molecular Feature Extractor (MFE)进行特征峰提取，去除干扰，导出特征峰化合物一级高分辨质谱（m/z）和保留时间信息（RT），与灯盏生脉PCDL化合物数据库进行匹配，将匹配到的成分生成灯盏生脉候选化合物列表；
3.基于灯盏生脉候选化合物列表进行Target MS/MS数据采集，结合Molecular Structure Correlator（MSC）结构解析软件和相关文献对化合物进行鉴定；
4.基于MHC-qTOF-MS系统，优化色谱质谱条件，采用第一维反相C8柱与第二维手性色谱柱（C8×Chiral）相结合，完成了灯盏生脉中部分同分异构体包括手性异构体的分离和鉴定。
5.将所有鉴定的化合物与药材进行关联分析与归属。
图2 灯盏生脉中化合物全面表征和鉴定的新策略
2LC×LC-qTOF-MS方法开发和优化
全二维液相色谱质谱系统具有高峰容量特征，适合复杂体系的成分分离和分析。本研究首先优化了灯盏生脉中化合物提取条件，分别采用50%、75%和100%乙醇作为灯盏生脉的提取溶剂。采集数据，应用Molecular Feature Extractor (MFE)模式进行特征峰提取，MFE模式进行峰提取包括以下几个标准：准分子离子峰检测，同位素峰检测，加合离子检测和色谱峰的反提，可较大程度的减少假阳性峰的干扰。根据MFE模式特征峰提取数量，最终选择75%乙醇作为提取溶剂（表1）。
表1 MFE模式下不同提取溶剂检测到的特征峰数量
接下来对第一维色谱分离条件进行了优化，根据文献调研，灯盏生脉中的有效成分主要包含有机酸类、黄酮类、皂苷类和木脂素类化合物，根据4类化合物在色谱柱上不同的保留行为，最终得到适用于4类化合物分析的最佳一维色谱条件（图3，Gradient 8）。
图3 LC×LC-qTOF-MS系统中第一维色谱条件的优化 (Gradient 1-8)
在第一维色谱质谱条件优化的基础上，优化全二维色谱条件。以有效峰容量（Effective 2Dn）作为指标，使用公式计算不同种类色谱柱搭配的有效峰容量，选择有效峰容量高的色谱柱组合，确定了最佳的第一维（Waters Xterra MS C8 (3.5μm, 2.1*100mm)）和第二维色谱柱（Agilent Eclipse Plus C18 (1.8 μm, 4.6*50 mm)）组合（表2）；然后分别比较了等度洗脱、分段洗脱和从动洗脱模式，计算有效峰容量（Effective 2Dn）和正交性系数（Ocom），选择最佳的色谱洗脱条件（洗脱模式优化见图4），最终选择了从动洗脱条件。确定的全二维液相色谱质谱方法可用于灯盏生脉中化合物的全面表征。
表2 全二维色谱系统中不同色谱柱组合的有效峰容量
图4 比较LC×LC-qTOF-MS方法中等度洗脱（Mode A）、分段洗脱（Mode B）和从动洗脱（Mode C）模式
灯盏生脉中包含的皂苷和木脂素类化合物包含有大量同分异构体化合物，其中部分化合物为手性化合物，常规反相液相色谱系统的全二维方法无法将这些化合物分离。基于此，应用多中心切割二维色谱质谱技术，对该部分化合物进行分析。采用手性色谱柱作为多中心切割第二维色谱柱，比较了大赛璐IC-3和IA-3两种适用于反相液相色谱系统的手性色谱柱，基于色谱柱的选择性和分离度，选择大赛璐CHIRALPAK® IC-3（4.6*150mm，3μm）作为第二维分析色谱柱（第二维手性色谱柱选择见图5），同时优化了第二维色谱梯度洗脱条件、流速（1mL和2mL）和分析时间（3min、5min、7min）等。最终确定的多中心切割方法（TIC图见图6），确定的多中心切割二维色谱质谱方法可满足皂苷和木脂素类同分异构体化合物的分析。
图5 比较MHC-qTOF-MS方法中CHIRALPAK® IA-3和CHIRALPAK® IC-3手性色谱柱
图 6 优化后MHC-qTOF-MS方法的TIC图 (28-29.5min)
应用已建立的全二维液相色谱质谱联用方法（LC×LC-qTOF-MS），对灯盏生脉提取物进行分析，识别和鉴定了灯盏生脉中283个成分，主要类别包括：有机酸类（58）、黄酮类（55）、皂苷类（83）和木脂素类（65）等化合物（主要类别化合物分布见图7）；针对皂苷和木脂素类成分分布较为集中，且存在大量同分异构体包括手性异构体的分离难点，采用多中心切割二维色谱质谱方法（MHC-qTOF-MS）进行分析，完成了灯盏生脉中12对同分异构体（包括1对手性异构体）的分离和鉴定（同分异构体化合物见图8）。
图7 LC×LC-qTOF-MS系统中各类化合物分布（A：负离子模式下化合物总EIC提取图；B：正离子模式下化合物总EIC提取图；C1：负离子模式下酚酸类化合物总EIC提取图；C2：负离子模式下黄酮类化合物总EIC提取图；C3：负离子模式下皂苷类化合物总EIC提取图；C4：正离子模式下木脂素类化合物总EIC提取图；）
图8 MHC-qTOF-MS分离和鉴定的同分异构化合物
本研究建立了基于LC×LC-qTOF-MS和MHC-qTOF-MS技术的灯盏生脉中化合物的全面表征和鉴定/同分异构体化合物的分离和鉴定策略，LC×LC-qTOF-MS实现了灯盏生脉中有机酸类、黄酮类、皂苷类和木脂素类化合物的区域分离和全面表征，MHC-qTOF-MS首次将反相分离和手性分离相结合，识别和鉴定了灯盏生脉中的12对同分异构体化合物。本研究建立的策略对于中药复方中成分的全面表征和和鉴定/同分异构体化合物的识别和鉴定具有重要参考价值。
研究成果已于2017年8月份发表在Journal of Chromatography A（IF=3.9）,研究工作得到中国医学科学院医学与健康科技创新工程创新团队项目（2016-12M-3-010 ）支持。中国医学科学院药物研究所分析室生宁博士研究生为该文第一作者。
Ning Sheng, Hao Zheng, Yao Xiao, Zhe Wang, Menglin Li, Jinlan Zhang∗. Chiral separation and chemical profile of Dengzhan Shengmai by integrating comprehensive with multiple heart-cutting two-dimensional liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1517 (2017) 97-107.
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课题组成员具有创新思维和过硬的技术实力，在药物分析新技术开发和应用方面实力雄厚，先后承担国家自然科学基金面上项目、自科基金青年项目、北京市自科基金1项、国家科研基础条件平台项目、863项目、卫生行业科研专项等。已培养毕业硕士和博士16人。已发表相关SCI论文70余篇。
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