摘要
侵袭性真菌病临床表现不典型，误诊率与病死率高，严重威胁人类的健康，早期、精确的诊断对于改善患者的预后意义重大，而微生物病原体实验室检查是侵袭性真菌病诊断的必备标准。侵袭性真菌病病原学的非培养实验室检测方法主要包括真菌抗原和抗体检测、快速检测技术以及分子生物学技术等，值得在临床推广应用。不同的抗原抗体可用于不同真菌感染的诊断，而以PCR和二代测序为代表的分子生物学检测诊断技术前景光明，但其临床应用之路却任重而道远。联合应用多种方法可以提高侵袭性真菌病的早期诊断水平。
随着器官移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂使用、侵袭性操作等不断增多，侵袭性真菌病（invasive fungal diseases，IFD）的发病率越来越高。早期诊断及恰当的抗真菌治疗是降低病死率的关键，但IFD的临床表现相对缺乏特异性，仅根据临床症状难以早期诊断，故误诊率高。因此，所有国内外IFD指南中均明确指出，临床诊断和确诊的依据必须包括病原微生物的实验室检查，后者是诊断标准极为重要的组成部分。近年来，真菌感染的病原学非培养检测技术有了长足的进步，主要包括真菌抗原和抗体检测、快速检测方法及分子生物学检测技术等，使IFD的临床诊断水平有了极大的提高。
一、分泌物标本的涂片镜检和真菌培养方法必须强调，即使在实验室检测技术飞速发展的今天，来自感染部位的分泌物标本的直接涂片镜检和真菌培养依然是IFD病原微生物实验室检查的基石。分泌物直接涂片通过显微镜检可看到真菌的芽孢、菌丝和假菌丝，真菌培养可根据菌落的外观、生化反应等对菌株进行鉴定和药敏试验，指导临床开展精准的抗真菌治疗。对于侵袭性肺真菌病（invasive pulmonary fungal diseases，IPFD）来说，临床标本来源于痰、气道吸引物、BALF、肺穿刺活检组织、经气管镜细针抽吸的组织或病灶内脓液穿刺等，但这些标本无论是否应用何种新技术进行检查，首先都应该常规进行涂片镜检和真菌培养。快速现场评估（rapid on-site evaluation，ROSE）技术对于提高真菌的检出率、减少不必要的穿刺有重要价值，若怀疑有真菌感染，即可送真菌培养及特殊染色。磁导航技术可使呼吸道病变部位标本的采集更加精确，再结合现代真菌检测技术将大大提高检查的精准性。但涂片镜检及真菌培养的阳性率较低，且培养耗时长，有可能延误最佳治疗时机；标本易受环境的污染，判断时必须结合临床。
二、真菌抗原检测方法1．G试验：已为临床医生熟悉的G试验检测的是真菌细胞壁成分——1，3-β-D葡聚糖（1，3-β-D-glucan，BG），人体吞噬细胞吞噬真菌后，可持续释放BG，使血液中含量增高，真菌定植时BG很少释放入血，因此有助于鉴别真菌的侵袭与定植。血清G试验适用于除隐球菌和毛霉外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉，但不能确定菌种，是诊断IFD如侵袭性念珠菌病（invasive Candidiasis，IC）、侵袭性曲霉病（invasive Aspergillosis，IA）、肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jiroveci pneumonia，PJP）等的早期敏感生物标志物之一。G试验诊断成人真菌感染的特异度为85.3%，敏感度为76.8%[1]，但容易出现假阳性的情况，如标本暴露在含有葡聚糖的材料上、败血症（尤其是链球菌导致的败血症）、使用多糖类抗癌药物、静脉滴注蛋白制品和血液制品等，阳性结果要结合临床进行综合分析。
2．GM试验：半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）是目前临床上应用最为广泛的IA生物标志物，曲霉丝生长时GM释放进入血液循环和局部病灶，可用于IA的早期诊断。曲霉感染时GM的释放量与菌量成正比，可以反映感染的严重程度，动态检测血清GM水平可反映治疗的疗效。对于粒细胞缺乏的患者，血清GM诊断IA的特异度大多超过85%，但敏感度差异较大，这与不同研究中的阈值不同有关。"2017欧洲曲霉病的诊断和治疗指南"建议，中性粒细胞减少症及造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）患者早期连续监测血清GM对IA诊断的敏感度高且有较高的阴性预测价值[2]。由于GM也可存在于患者的其他体液中，如BALF、尿液和脑脊液等，特别是对侵袭性肺曲霉病（invasive pulmonary Aspergillosis，IPA）患者来说，检测BALF中GM水平已成为临床常用且可靠的方法，其诊断的敏感度和特异度均在80%以上，阳性预测值和阴性预测值均优于血清GM。因此，即使是粒细胞缺乏患者，如果给予了预防性抗真菌治疗或已经在院外进行了抗真菌治疗，对拟诊IPA的患者应同时检测血清和BALF中的GM水平[2]。
GM试验要特别注意存在假阳性和假阴性的情况，尤其在免疫功能正常的非粒细胞缺乏患者，中性粒细胞会阻碍曲霉侵入血管，并可吞噬进入血液的GM抗原，造成血清GM试验的敏感度大大降低（<50%），阴性结果并不能除外曲霉感染；同时有效的抗真菌治疗也会明显降低血清GM试验的敏感度（接近50%），这一点必须引起呼吸科医生的重视，仅凭血清GM试验阴性不能排除曲霉感染。同时，抗真菌治疗可降低血清GM水平，但短期内不会影响BALF中GM的检测结果[3]，因此，对于非粒细胞缺乏的患者更强调检测BALF中的GM水平。假阳性通常与使用国产的半合成青霉素制剂（可能是产品中的杂质所致）、新生儿和儿童、血液透析、自身免疫性肝病、输注含有葡聚糖的蛋白制剂或食用菌类食品等因素有关。联合进行血清和BALF中GM和血清G试验，可以弥补各自的缺点，提高检出率，降低误诊率。
3．隐球菌荚膜多糖抗原（Cryptococcus antigen，CRAG）检测：通过检测血清或脑脊液中的CRAG诊断隐球菌病的敏感度及特异度均高达90%以上[4]。CRAG检测通常采用乳胶凝集法和酶联免疫分析法，对隐球菌病的诊断价值均较高。我国2018年制定的"隐球菌性脑膜炎诊治专家共识"中指出，脑脊液CRAG阳性提示隐球菌感染，滴度的高低提示疾病的严重程度[5]。免疫功能缺陷的肺隐球菌病患者血清CRAG阳性率也具有较高的敏感度和特异度，但非免疫功能受损的单纯肺隐球菌病患者CRAG的阳性率并不高（仅有56%），阴性不能排除感染[6]。血清CRAG强阳性的患者，应进一步检查脑脊液以排除中枢神经系统隐球菌感染。血清CRAG滴度高低与病情严重程度相关，有效的抗真菌治疗可以降低CRAG的滴度，但是否转阴不能作为停药的指标。此外，尿和BALF标本也可用于CRAG的检测，均有良好的应用前景。
4．念珠菌甘露聚糖（Manann，Mn）抗原检测：Mn是念珠菌属表面除葡聚糖外的另一种重要的细胞壁抗原，在念珠菌侵犯机体深部组织、器官时，被巨噬细胞吞噬，激活体内免疫系统而被清除，因此，检测Mn抗原有助于区分念珠菌是定植还是侵袭性感染[7]。Mn抗原诊断念珠菌血症的敏感度为58%，特异度为59%，与Mn抗体联合检测的敏感度和特异度分别升至83%和86%[8]。Mn抗原在血液中容易被清除，连续检测可提高阳性率[9]。
5．曲霉尿抗原检测：曲霉感染哺乳动物后，尿液中会产生呋喃半乳糖抗原，通过侧流免疫分析法，利用半乳糖特异性单克隆抗体（mAB476）可快速检测尿液中的抗原。Marr等[10]的研究结果表明，曲霉尿抗原检测对IA的诊断具有良好的检测效能，尤其是血液系统恶性肿瘤和HSCT患者，敏感度和特异度分别为89.5%和90.9%，且尿曲霉抗原的检测结果与血清GM试验的结果具有一致性。
2019年欧洲临床微生物与感染性疾病学术年会上，有研究者报道了一种新的诊断曲霉感染的敏感方法，系采用傅里叶变换离子回旋共振质谱法检测曲霉感染机体后在尿液中的代谢产物。TAFC、FC、GTX是烟曲霉感染人体后在转运"铁"过程中产生的一些小分子螯合物。一项入选了14例烟曲霉培养阳性的IPA患者（包括中性粒细胞正常与减少的患者）及14例阴性对照者的研究结果表明，与血清GM试验73%的特异度相比，患者尿中的代谢物TAFC、FC、GTX的诊断特异度高达100%，TAFC的敏感度为92.9%，FC及GTX的敏感度偏低（均为42.9%），显示了良好的应用前景。
三、真菌抗体检测方法1．曲霉特异性抗体检测：对免疫功能正常的患者具有较高的辅助诊断价值，特别是曲霉特异性IgG和IgE抗体，可作为临床诊断的微生物学指标。人与动物真菌国际学会的专家共识中将血清曲霉特异性IgE抗体阳性作为诊断变应性支气管肺曲霉病（allergic bronchopulmonary Aspergillosis，ABPA）的必要条件之一[11]。2016美国"IDSA曲霉病临床诊断和治疗实践指南"及"2017欧洲曲霉病诊断和治疗指南"均认为曲霉特异性IgG抗体阳性是慢性肺曲霉病（chronic pulmonary Aspergillosis，CPA）最为敏感、可靠的微生物学诊断指标[2]。目前认为曲霉特异性IgG还不能作为急性侵袭性曲霉病（acute invasive Aspergillosis，AIA）的早期诊断指标，而曲霉特异性IgA和IgM的诊断价值仍在探索中。但免疫功能缺陷的患者由于免疫功能不健全，导致抗体形成延迟或减少，甚至缺失，抗体检测的敏感度仅为25%~30%[12]。
2．念珠菌特异性抗体检测：包括念珠菌烯醇化酶IgG抗体、Mn抗体、芽管抗体及果糖二磷酸醛羧酶抗体等，有助于早期IC的快速诊断及区分念珠菌的定植或感染，且与其他真菌无交叉反应，联合检测可以提高阳性率。
念珠菌Mn抗体：念珠菌Mn抗原可引起很强的抗体反应，刺激免疫系统产生IgG和IgM抗体。Mn抗原和抗体同时检测可提高诊断念珠菌血症的敏感度和特异度[8,13]。2012欧洲临床微生物与感染性疾病学会推荐血清Mn和抗Mn抗体作为IC的早期诊断手段[14]。Mn抗体对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌的敏感度可达58%~70%，但对于克柔念珠菌及近平滑念珠菌的敏感度仅为25%~30%[15]。
念珠菌芽管抗体（Candida germ tube antibody，CAGTA）：念珠菌芽管是念珠菌进行组织侵袭和生物膜形成过程中表达的菌丝蛋白，芽管产生后刺激机体产生抗体。CAGTA检测的敏感度高于G试验，而检测成本相对较低，耗时较短[16]。在危重症患者IC的研究中，CAGTA检测诊断的敏感度和特异度分别为53%~96%和64%~100%[17,18]。早期检测CAGTA有助于早期识别念珠菌感染，即使在免疫功能缺陷的患者也能检测出来[19]。
果糖二磷酸醛羧酶（fructose-bisphosphate aldolase，Fbal）抗体：念珠菌Fbal只有在侵袭性感染时才会大量释放入血，刺激机体产生抗体，因此可有效区分念珠菌感染或定植。IC患者血清中抗Fbal抗体高于非IC患者，抗Fbal抗体对诊断IC的敏感度和特异度分别为98%和96%，但粒细胞减少患者的抗Fbal抗体阳性检出率明显降低，故免疫功能抑制的患者应联合其他检测方法诊断IC[20]。
四、快速检测方法（胶体金法和层析侧流装置）层析侧流装置（lateral-flow device，LFD）[21]是利用胶体金免疫层析技术诊断疾病的一种设备，特点是可以快速检测，通常仅需15 min即可报告结果，敏感度高、特异度好、操作简单，目前已经应用于曲霉、念珠菌及隐球菌感染时相关抗原的检测。
1．曲霉外糖蛋白：LFD技术将抗曲霉胞外糖蛋白的单克隆抗体JF5作为检测抗体，检测患者血清或BALF中的曲霉胞外糖蛋白。JF5与曲霉属外糖蛋白抗原可发生强免疫反应，与隐球菌、念珠菌等无交叉反应。JF5标记抗原后，发现JF5仅存在于萌发的孢子和菌丝表面，而休眠的孢子表面不出现，由此可区分侵袭性生长的曲霉和静止的孢子。BALF中曲霉外糖蛋白LFD检测与BALF的GM试验效果相当[22]，BALF中曲霉外糖蛋白LFD检测的敏感度和特异度分别为86%和93%，血清LFD检测的敏感度和特异度分别为68%和87%，BALF的LFD检测效果优于血清LFD检测[23]。
2．曲霉GM：采用侧流层析方法（lateral flow assay，LFA）快速检测曲霉感染患者BALF中的GM，克服了ELISA方法检测GM耗时长的局限性，且一致性好，可用于床边快速检测。Jenks等[24]采用LFA方法检测血液系统恶性肿瘤患者BALF中的GM，诊断IPA的特异度（88%）和敏感度（89%）较高，与BALF中曲霉外糖蛋白LFD联合检测时的敏感度高达100%。采用LFA方法检测非中性粒细胞减少的IPA患者BALF中的GM，其特异度为68%，敏感度为69%，与BALF中曲霉外糖蛋白联合检测使诊断的敏感度提高至81%[25]。但也有作者发现，LFA与酶联免疫分析法检测BALF中GM的一致性在阴性结果（<0.5）和明显阳性结果（>3.0）时很好，但结果在0.5~3.0之间时的可靠性较差，需要进一步研究。
3．念珠菌烯醇化酶（enolase，Eno）抗体：Eno是白念珠菌的胞内酶，在念珠菌侵染宿主时可引发宿主产生高滴度的IgG抗体，血清中抗Eno-IgG检测与血培养结果的一致性较好，且抗Eno-IgG在感染早期即可升高，与G试验联合应用能很好地辅助诊断IC，但因免疫功能低下患者的抗体水平较低，故存在假阴性的情况[20,26]。目前建立了一种快速检测抗Eno-IgG的LFD法[27]，诊断IC的的特异度（96%）和敏感度（71%）较高，可在早期筛查性实验中较可靠地发现IC患者。
4．念珠菌Mn抗体：张如岗等[28]用胶体金方法检测肺念珠菌病患者血液标本中念珠菌MnIgM和IgG抗体发现，用该方法检测念珠菌MnIgM抗体的敏感度和特异度分别为100%和64%，IgG抗体分别为88%和78%，此方法鉴于胶体金免疫层析技术的优点，可更加快速、简便、有效诊断念珠菌病，但目前利用该方法检测念珠菌抗体的研究仍较缺乏，需要更多的临床研究结果证实。
5．隐球菌荚膜多糖抗原：在诊断新生隐球菌感染时，利用胶体金法可定性或半定量（滴度检测）检测CRAG，敏感度可达99.3%，特异度>99.1%，是一种可靠的隐球菌感染辅助诊断手段[29]。文献报道LFD法比乳胶凝集试验和酶联免疫分析法的可信度更高[30]，但在检测时应注意样本浓度不能过高，否则会出现假阴性（高剂量钩状效应），出现此种情况时可进行半定量检测。
五、分子生物学检测方法1．聚合酶链式反应（PCR）：应用PCR技术可快速、特异地检测真菌感染患者各种临床标本，如血液、BALF、肺组织、气道分泌物和痰液等。2017年"欧洲曲霉病诊断和治疗指南"中指出，PCR检测联合其他生物标志物检测（如G试验或GM试验），能够提高IA的诊断精度；对于免疫功能低下的患者，用BALF-PCR与BALF-GM试验（阳性阈值>1.0）联合诊断IA，其敏感度高达100%，特异度为95%~98%；对于活检组织中发现菌丝阳性的患者，指南中强力推荐进行真菌分子生物学检测[2]。PCR检测在BALF中的敏感度比血液标本中更高，有利于早期诊断[31]。一项采用RT-qPCR检测BALF中曲霉的研究结果表明，qPCR和GM试验的敏感度（90%，90%）较高，但qPCR的特异度明显高于GM试验（92.5%，68.8%）[32]，提示设计严谨、精确定量的qPCR检测效能优于GM试验。
PCR方法已经非常成熟，巢式PCR、实时PCR、多重PCR及限制性片段长度多态性PCR等越来越多的方式出现，进一步提高了临床标本检测的阳性率及时效性。但由于不同实验室使用的引物、反应条件及仪器不同，PCR诊断IFD的敏感度和特异度相差较大，并存在假阳性的情况[33]。PCR只能检测已知的特定病原体，难以用于未知微生物的检测，是这类技术的最大障碍[34]。
2．环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）：是一种等温核酸扩增技术[35]，只需要具有链置换活性的DNA聚合酶和一组特异识别目标DNA上6个不同位点的2对引物，即可快速、特异性扩增靶标DNA。在真菌检测方面，可实现对真菌的快速检测与鉴定，对诊断、治疗和预防由真菌及其代谢产物引起的疾病有重要意义，但其同时也存在引物设计复杂、反应体系易污染、扩增产物难以定量等问题。
3．宏基因二代测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）：基因测序技术无需对病原体进行分类培养，也不依赖已知的核酸序列，可直接对临床标本进行撒网式的测序，通过微生物专用数据库比对和智能化算法分析，获得疑似致病微生物的种属信息，为疑难危重感染提供快速精准的诊断依据[36]。二代测序又称高通量测序，在不需要预先知道可疑病原体的前提下，直接提取标本中的全部核酸片段并检测，鉴定出标本中所含核酸的种类，并可对病原体的序列数、覆盖度等进行定量分析。目前，采用针对18 s保守序列进行二代测序可检测所有的真菌，采用全序列的二代测序（所谓鸟枪法）可对包括念珠菌属和曲霉属在内的所有微生物序列进行识别，并可在种的水平上进行鉴别[37]。Long等[38]在北京协和医院重症监护室进行的脓毒血症研究，仅定位细菌和真菌，以培养结果为"金标准"，二代测序的敏感度和特异度分别为72.7%和89.6%，采用血培养联合二代测序诊断细菌或真菌感染的阳性率比单用血培养显著升高。二代测序可检测出大量微生物序列，其快速、无偏的优势补充了传统病原学诊断的不足，有极大的临床应用前景。但mNGS的检测费用较为昂贵，尚无公认的判读标准，缺乏与传统诊断方法大规模的比较验证，与治疗的关系尚不明确，还需要在临床实践中进一步完善。
分子生物学技术临床应用仍有许多难点需要克服。首先，检测真菌病原体核酸的敏感度取决于组织样品中真菌细胞的有效裂解和DNA的纯化，真菌因其胞壁较厚，加大了核酸提取的难度。其次，分子生物学技术难以分辨定植和侵袭性感染，需要结合临床表现及其他资料进一步分析。另外，抗真菌药物治疗后可能会降低检测的信号强度。
六、其他检测方法1．基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测技术（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）：微生物物种都有自己特定的蛋白质指纹图谱，通过仪器或软件的分析比对，找出自身特异的图谱，用于鉴别待测物质。MALDI-TOF MS法鉴定酵母菌的准确率为92.5%~99.0%[39]，但MALDI-TOF MS必须在培养阳性的基础上进行，且真菌在不同的培养基、培养温度及时间、蛋白表达方面存在差异，可能影响鉴定结果，尚需要进一步进行标准化研究。
2．醋酸镰孢氨酸C（fusarine acetate C，TAFC）：BALF-TAFC检测诊断IPA的敏感度和特异度分别为40%和79%，TAFC和GM试验联合检测的敏度可达87%[40]，但目前TAFC的最佳临界值及其在血液等其他体液中的诊断价值尚需要更多的研究结果证实。
3．T2Candida panel：其基本原理是扩增全血样本中的念珠菌DNA，利用磁共振技术检测扩增的DNA，如果有酵母DNA，T2Candida panel将自动确定酵母病原体的种类，其敏感度和特异度分别高达91%和98%[41]。该方法检测快速、方便，但只能检测5种念珠菌（白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌或克柔念珠菌），且不能准确区分白色念珠菌和热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌。由于价值有限且费用昂贵，尚未在临床广泛应用。
4．二甲硫基胶霉素[Bis（methylthio）gliotoxin，bmGT]：在侵袭性曲霉病动物模型和临床确诊患者血清中均可检测到胶霉素，而bmGT是胶霉素甲基化后的代谢产物。文献报道，在IA高危患者的血清中可检测到[42]，bmGT与GM试验联合检测的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.5%，是一种有研究前景的血清标志物，但其诊断价值仍需进一步证实。
综上所述，近年来IFD的病原学实验室诊断方法有了极大的进展，为临床诊疗提供了便捷可靠的依据，但各项检测方法均存在一定的优缺点，需要根据临床实际进行筛选、验证，必要时进行联合检测，以满足临床的需求，达到最优异的检测结果。参考文献（略）