究竟证实还是证伪？坐标NgAgo，各方热议Cell Research文章！【中国科讯】
专业解读
柏玉洁 中国科学院 生物物理研究所
贠（yùn）涛 北京大学 前沿交叉学科研究
11月11日，Cell Research 《细胞研究》 在线发表了题为《基于NgAgo的fabp11a基因敲低引起的斑马鱼眼睛发育缺陷》的论文。该文章在尝试理解fabp11a在斑马鱼胚胎发育中作用的同时，顺带验证了NgAgo基因编辑技术的可行性, 而研究团队观察的结果却是：NgAgo确实可以改变斑马鱼的表型，但并非通过基因编辑，而是依靠基因敲低来实现的！
首先是作者们：
我们的研究是在斑马鱼模型上做的，我们没有发现indels，但是可以抑制基因表达，推测是结合到了DNA上，阻止了转录。并没有支持或者反驳韩教授的结果。实际上这个研究是我们意外的一个小发现。（来自Bioart）
我们的文章是在斑马鱼里做的。结果显示不能切割DNA，但是可以抑制基因表达，我们推测是结合到了靶基因上并阻止其转录，这并没有支持或者反驳韩春雨教授的结果。（作者系复旦大学生命科学学院研究员）(来自赛先生)
然后是网友们：
这篇文章并不支持韩春雨的结果，是knockdown，不是knockout。此文章研究发现NgAgo系统只是下调了目标基因的表达水平，并没有引入任何点突变或者插入缺失，这与韩春雨实验的结果不一致。
NgAgo确实可以改变斑马鱼的表型，但这并非是通过基因编辑实现的。事实上，团队通过实验得出结论，NgAgo系统可以在不改变目标基因序列的情况下，对基因表达实现 knockdown（即下调其目标mRNA表达水平），且这可能与NgAgo的基因剪切活性没有关系。
韩春雨文章对NgAgo功能的描述完全不靠谱。NgAgo并不能在斑马鱼里做基因组编辑（knockout）。NgAgo能够抑制RNA表达（knockdown），机制不明，与韩春雨所声称的NgAgo的功能完全相反：NgAgo可以进行基因组编辑，并排除了表达量下降是由其他原因造成的。
这篇论文的报道并不代表韩春雨老师NBT的工作被证实了，后续可能还需要相关的工作去进一步解释说明，特别是解释RNAi的机制是什么，或许结构生物学能给出一些答案。
可以看出大家的观点基本一致，在斑马鱼身上并没有观察到韩春雨实验的结果—gDNA/NgAgo系统的基因编辑的敲除（Knockout）作用。但有趣的是，却发现了gDNA/NgAgo系统在斑马鱼体内可以发挥基因表达敲低的作用（Knockdown）。
☛ Knockout：是敲除，就是在DNA水平上造成目标基因从整个基因组里去除、产生突变或碱基片段缺失，使目标基因完全没有表达。
☛Knockdown：是敲低，就是在RNA水平上（即转录与翻译过程），用各种方法抑制目标基因的表达，但基因保持完整性和正确。
☛ 这两种方法都是常用的技术，一般敲低在手段更容易实现，敲除在效果上更好，现实实验中还是根据实际情况来定，而二者最明显的区别是基因组DNA序列是否发生变化。
说到这里，这篇文章究竟是通过怎样的方法得出结论？
小编认真学习了相关知识，翻阅研读了各种专业书籍和科研网站，艰难理清了整个实验过程，下面对照原文，我为大家……邀请到了基因方面专业人士进行回答：
首先，作者按照gDNA/NgAgo系统的设计原则进行了胚胎注射。在注射了NgAgo mRNA和靶向单链DNA的实验组胚胎细胞中发现，30%的斑马鱼胚胎在发育后出现了眼部畸形。
但对有缺陷的个体fabp11a基因测序后并没有发生突变和碱基删减。于是作者对缺陷个体进行了RT-PCR检测，发现fabp11a基因表达有显著敲低。
▲Figure 1 刘东研究组实验流程图解
为了进一步验证gDNA/NgAgo系统基因编辑作用，作者利用了CRISPR/Cas9基因编辑系统作为阳性对照；另一方面，对于新发现的gDNA/NgAgo系统具有基因敲低的作用，作者还利用了在斑马鱼中广泛使用的吗啉翻译阻断技术（translation-blocking morpholino）作为基因表达敲低作用的阳性对照。
CRISPR/Cas9基因编辑系统，作为第三代基因编辑技术，是目前最流行和被广泛认可的基因编辑技术。特点是，编辑效率高，gRNA序列设计原则简单，普遍适用于各个模式生物系统。
吗啉翻译阻断技术，作为在发育生物学中经典的基因表达敲低技术，广泛地应用于以斑马鱼和青蛙为动物模型的研究中，基因表达敲低效率高，细胞毒性小，缺点是有一定的脱靶作用。
刘东研究组利用这两种已广泛应用的方法作为对照，证明了利用gDNA/NgAgo系统不能在斑马鱼系统中引入靶标基因的缺失与其他类型的突变（DNA水平上没有作用）。但是gDNA/NgAgo系统却能高效地引发基因敲低（knockdown）（RNA水平上发挥作用）。
仔细阅读原文可以看出，韩春雨的方法与本文最大的差异是实验系统的差异，即一个在哺乳动物细胞中，一个在斑马鱼中。其他可能存在的差异也许是实验操作细节的差异。
此外，作者自身也考虑到温度因素（斑马鱼的培养温度为28.5度，而韩春雨方法是在哺乳动物细胞培养温度37度下进行），并同时在37度的条件下进行了实验，但仅提到没有检测到基因组的突变或碱基删除，并没有呈现实验数据（data not shown）。
总之，刘东研究组的实验并不是直接证明，而是侧面暗示了韩的方法并没有如其所宣称的基因编辑作用。
到此事件还在持续发酵中，小编从心底期待gDNA/NgAgo系统可以作为基因编辑工具被科学界所应用成真，也希望韩春雨老师可以打破质疑能拿出改良的且更加详细的实验操作流程，供同行研究组进行验证，小编真心以为只要是造福人类的技术，即使花再长时间去验证它，都不会是徒劳无功。
韩春雨事件回顾
5月2日，世界顶级学术刊物《自然·生物技术》刊发了河北科技大学副教授韩春雨的论文《NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具》。
8月2日，《自然·生物技术》发表声明称，“作为在自然科研旗下期刊发表论文的条件之一，作者须将材料、数据、代码和相关的实验流程及时向读者提供，不可加以不当限制。”
8月8日，韩春雨向非盈利性质粒共享信息库Addgene提交新版的详细实验方法，并补充了4项应当注意的问题。
8月8日，《自然》杂志网站发表一篇报道，详细记述了多国科学家对于韩春雨的NgAgo的争论。文章指出，来自澳大利亚、西班牙等国的科研人员表示实验不可重复。
10月14日，河北科技大学就韩春雨实验结果受质疑作出书面回应称：已有机构用韩春雨团队技术实现基因编辑，具体信息会适时向社会公布
基因编辑技术
第一代基因编辑技术是同源重组建立动物基因敲除（knock-out），基因敲入（knock-in）的基因突变模型。
该技术流程复杂，耗时长，成本高，应用面较窄，一般来用于建立遗传疾病研究的动物模型，很难用于临床。
第二代基因编辑技术是ZFN、TALEN技术。二者均通过DNA核酸结合蛋白和核酸内切酶结合在一起建立一个系统，对特定的基因进行基因敲除和基因突变。
该类技术ZFN和TALEN设计较为复杂，操作过程繁琐，脱靶率高，且具有细胞毒性，但是与第一代相比，时间和金钱成本都大大降低，且是在细胞水平上进行操作，应用范围更广。
第三代基因编辑技术是CRISPR/Cas9 系统。其原理是利用核糖体结构来进行基因编辑。
CRISPR/Cas9 系统经过一定的设计可以结合到靶基因上，然后对这个靶基因进行敲除、定点突变或者引入新的外源基因，来进行基因编辑。
该系统具有第二代编辑技术的优点，同时简化了设计和实验流程，并把编辑效率提高到了一个比较理想的状态。但科学家们还是在力图升级这个系统，希望能够进一步简化操作，提高编辑效率，降低脱靶。
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