杜氏肌营养不良（DMD）基因治疗新进展

杜氏肌营养不良（又称假肥大性肌营养不良，DMD）为一种致死性的X性连锁隐性单基因遗传病，是进行性肌营养不良病中最严重与最常见的一种，其发病率为1/3500男孩。通常3~5岁出现临床症状，随着病情的逐渐恶化，12~13岁前丧失行走能力，20岁左右死于呼吸衰竭或心力衰竭。本病是由肌萎缩蛋白（dystrophin）基因突变导致的，约 1/3 病例为散发，无家族遗传史。现行的治疗手段只能有限地延缓疾病进程，基因治疗为该病的有效治疗，甚至治愈带来了曙光。

目前，许多以重建正常的肌萎缩蛋白表达为目标的基因治疗处于临床前和早期临床试验阶段，虽然此疗法的潜力巨大，但由于诸多技术难题尚未解决，目前的效果不甚理想。基因治疗DMD的主要困难在于人类肌萎缩蛋白基因太大，是目前已知的最大基因，其cDNA 长达14kb，多数病毒基因载体难以包装运载，尽管腺病毒等少数病毒基因载体及一些非病毒基因载体可以装载大片段基因，但多种因素导致其最终的运载效率低下，需进一步优化。

早期对于临床症状轻微的贝式肌营养不良（BMD）研究发现患者肌萎缩蛋白基因缺失了第17~48号外显子，缺失占整个基因的46%。据此，研究人员克隆构建了缩短的dystrophin基因，即mini-肌萎缩蛋白。经转基因鼠模型验证，此基因编码产物基本可以满足机体的正常生理机能需求。此外，有研究人员通过敲除该基因编码中央杆状区部分片段，构建了进一步缩短的micro-肌萎缩蛋白。micro-肌萎缩蛋白功能上能够重建肌纤维的稳定性，但由于它缺失Mark2-结合位点（第26和23外显子），无法纠正患者肌卫星细胞的极性缺陷，而肌卫星细胞正常极性是其修复受损肌纤维的条件之一。因此，发展包含Mark2-结合位点的micro-肌萎缩蛋白基因用于基因治疗，有利于重建健康的肌卫星细胞，进而提高其临床疗效。另外，目前慢病毒介导的micro-肌萎缩蛋白基因的传递效率虽然较低，但它成功将micro-肌萎缩蛋白基因导入一部分肌卫星细胞，保持肌萎缩蛋白在成肌细胞持续表达数年之久。因此，鉴于肌卫星细胞的持续自我更新及分化特性，将它作为基因治疗的主要目标细胞有利于提高疗效的持久性。

除了上述的基因治疗策略外，另一种有潜力的较早提出的治疗策略是反义寡核苷酸技术介导的外显子跳跃剪接。主要原理是：反义寡核苷酸与肌萎缩蛋白基因pre-mRNA 突变外显子相应区域特异结合，干扰其剪接，导致跳过此突变外显子进行剪接，恢复了肌萎缩蛋白基因mRNA的正确读码框架，进而恢复了肌萎缩蛋白的部分功能。临床前动物试验及体外人细胞试验中表现出了一定的治疗效果，但由于导入细胞内的反义寡核苷酸稳定性较差，导致其疗效持续时间较短。

CRISPR-Cas9基因编辑技术的发展为直接在基因组水平精确高效切除肌萎缩蛋白基因突变外现显子成为可能，尽管当前的技术难题较多且潜在的治疗流程繁琐，需要针对每位患者不同的突变对其进行个性化治疗，但其临床应用潜力巨大，据估计此疗法可以切除近80% DMD患者的致病突变。近期，不同的研究团队先后证明:腺相关病毒为载体运载CRISPR-Cas9系统精确敲除突变的外显子23，使mdx小鼠的肌萎缩蛋白功能得以重建，但表达水平较低。原因之一在于腺相关病毒载体对于非分裂期的肌卫星细胞的基因导入效率极其低下，这会明显影响其治疗效果。可喜的是，近期鉴定出的一种AAV受体（PMID:）使得AAV载体的基因传递效率有望取得大的提高。

尽管，DMD基因治疗取得了一系列突破，但是还存在诸多技术难题，尤其是基因运载系统的基因传递效率低，这仍旧是阻碍基因治疗临床疗效的最大障碍。随着，技术的进步，诸多难题将逐步攻克，基因治疗是未来治愈DMD的有效手段，也是未来医疗的大势所趋。（欢迎分享本文，转载请保留出处：微信公众号基因治疗领域）