行业分析|“上帝的剪刀”——CRISPR-Cas9的前世今生
来源：华兴创业
2015年底，《科学》杂志将CRISPR-Cas9技术列为“年度十大科学发现”之首。这项被誉为“上帝的剪刀”的技术让人们拥有了前所未有的基因编辑能力，能以低廉的成本精确地修改DNA 片段。如今，几乎所有基因技术研究机构都会用到这项技术。
CRISPR-Cas9技术的三位先驱人物
Jennifer Doudna（杜德纳）
任教于加州大学伯克利分校
Emmanuelle Charpentier（卡彭蒂耶）
任教于瑞典于默奥大学
华裔科学家张锋
任职于麻省理工博德研究所
在杜德纳和卡彭蒂耶之前，没太多人关心CRISPR，正是她们的基础研究使得CRISPR作为一种基因编辑技术成为可能。
而张锋则第一个实现了CRISPR在哺乳动物细胞里编辑基因组的应用，张锋及所在的博德研究所因此于2014年获得了CRISPR领域的首项专利。2015年，杜德纳和卡彭蒂耶提起抗辩。
最终，在2017年2月15日，美国专利与商标局（USPTO）裁定对张锋及博德研究所2014年获批的CRISPR-Cas9专利不作更改。这项内涵极其深广的专利涵盖了CRISPR-Cas9技术在所有真核生物（动物、农作物和人类自身）中的应用，这是CRISPR技术商业化最为核心的专利之一。
2月15日当天，张锋等人创立的生物技术公司Editas Medicine的股价上涨近30%。（Editas由Google等公司投资，于2016年2月3日登陆美国纳斯达克上市。）
除了专利争端之外，另一个焦点则是诺贝尔奖。在很多人看来，诺贝尔奖已经是CRISPR技术的囊中之物，唯一的问题是谁将最终站在领奖台上。
CRISPR-Cas9的前世今生
CRISPR-Cas9的发现历程
1、CRISPR-Cas9是什么？
• CRISPR-Cas是一种细菌及古细菌的获得性免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。在细菌的基因组上，存在着特殊的CRISPR序列（clustered, regularly interspaced,short palindromic repeats），成簇规律间隔短回文重复序列。当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，CRISPR产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR-Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。
• 正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR-Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。CRISPR-Cas系统拥有三种类别，其中CRISPR-Cas9是目前研究最深入，应用最成熟的一种类别。
• CRISPR-Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着其成本低廉、操作方便、效率高等优点，CRISPR-Cas9迅速成为了当今最主流的基因编辑技术。
• 从科学界首次报道CRISPR的1987年至今，已经过去三十年，而CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术在最近5年里才真正在生命科学领域大放异彩。
• 2012年，Jennifer Doudna（詹妮弗· 杜德纳）和Emmanuelle Charpentier（埃马纽埃尔·卡彭蒂耶）在Nature杂志上发表论文，首次提出CRISPR-Cas9可以作为简单、灵活的基因组编辑工具。两人因此获得了2015年的“生命科学突破奖”。从那以后最新一代基因编辑技术才真正全面应用到生命科学的各个领域，并迅速崛起，引发新的革命。
2、CRISPR-Cas9如何被发现
CRISPR与锌指蛋白（ZFN）和TALEN蛋白一样，同样是亿万年进化的产物，不过CRISPR原本可不是精密调节基因组的开关，而是——细菌的免疫系统，用于对抗入侵的病毒，比如噬菌体。病毒作为地球上最简单的有机生命形式，没有独立生存繁衍的能力，通过入侵宿主细胞、利用宿主细胞的资源复制自身，完成生命繁衍的循环。
（1）对付噬菌体的杀手锏——CRISPR系统
从CRISPR的全名“成簇规律间隔短回文重复序列”来看，CRISPR本身其实就是细菌基因组DNA上的一段特殊的序列，包含若干重复序列及非重复序列，每个重复序列或非重复序列的长度是几十个碱基。这张图描述了一段典型的CRISPR序列。用数字标记的浅蓝色线段代表了串联间隔重复的DNA序列，而深蓝色的线段则是千变万化的非重复序列。
1987年，日本科学家在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近首次发现了串联间隔重复序列，之后十几年间，世界各地的科学家陆续在不同的细菌中发现了类似的CRISPR序列，但是始终不清楚这意味着什么。
2000年，几位西班牙科学家比对了当时已经具有完整基因组信息的多种细菌，发现二十多种细菌及古细菌里，都带有结构组成相当类似的CRISPR序列。 到2005年，他们继续搜集了六十多种细菌中的4500段CRISPR非重复序列信息，发现其中88段居然在不同物种中重复出现。更妙的是，这其中的47个序列，与许多当时已知的噬菌体基因组序列信息高度一致。
细菌基因组的深处，隐藏了噬菌体病毒的“身份信息”。生物学家们的第一反应是：CRISPR序列是用来对付噬菌体入侵的武器。
2007年，一群在杜邦公司旗下的丹尼斯克（Danisco）食品配料公司工作的科学家，在嗜热链球菌中，严格证明了CRISPR序列对于细菌免疫系统的功能。那么，一段CRISPR序列，怎么能识别并抵挡病毒入侵呢？
（2）CRISPR序列的作用
后来的研究发现，细菌的CRISPR序列在正常情况下可以被转录成RNA分子，游离于细胞当中。这些小段CRISPR RNA分子充当向导的角色，带着一个蛋白复合体，在细胞体内终日游荡。当有病毒入侵，复合体发现某段病毒DNA的序列和自身向导的序列匹配时，即可切断病毒DNA，使其失去继续利用细菌资源生存和繁衍的能力。
2012年夏天，杜德纳和卡彭蒂耶联手证明，体外纯化的Cas9蛋白可以单独发挥定位和切割基因组DNA的功能。如果人工编辑CRISPR RNA，即可让Cas9蛋白指哪打哪，切割任意指定的DNA。这个结果清晰地指向了一种全新的基因组编辑技术：理论上人们只需要设计一段几十个碱基的CRISPR，加上天然存在的Cas9蛋白，即可随心所欲地定位和修改任何一段目标基因了。
此时，距离基于TALEN蛋白的上一代的基因组编辑技术问世不过短短一年。
2014年，杜德纳和卡彭蒂耶的合作最终完美解释了CRISPR-Cas9系统的工作原理：Cas9蛋白就像一个有着两块卡槽的接线板，能够同时插进一条CRISPR RNA和一条病毒基因组DNA，而当CRISPR RNA和病毒DNA的序列对应时，Cas9蛋白会发生变形，准确地卡住病毒DNA并毫不犹豫的挥起剪刀。
CRISPR-Cas9的具体机制
1、CRISPR-Cas9系统的构成
CRISPR-Cas9技术的灵感来源于细菌及古细菌的获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR-Cas系统实现的。细菌基因组上，CRISPR位点主要由Cas基因，前导区域，CRISPR序列构成。间隔区是源自外源病毒的序列，称为“间隔序列（Spacer）” ，在病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列（Protospacer）”与之对应。
在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas9即可（Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链），这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。
2、CRISPR获得性免疫的流程
Stage 1：外源DNA俘获 ——“黑名单”登记
CRISPR-Cas系统在这一步实现了 “黑名单登记”功能。CRISPR-Cas系统将识别出入侵者的“名字”（PAM）并找到它的“身份证”（原间隔序列），然后把入侵者身份信息作为“档案”（间隔序列）记录到“黑名单”（CRISPR序列）中。
当噬菌体病毒首次入侵宿主细菌，病毒将双链DNA注入细胞内部。CRISPR-Cas系统会从这段外源DNA中截取一段序列作为外源DNA的“身份证”，然后将其作为新的间隔序列被整合到基因组的CRISPR序列之中。因此，这段与间隔序列对应的“身份证”被称为原间隔序列（protospacer）。
然而，“身份证”的选取并不是随机的。原间隔序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，被称为原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。
病毒首次入侵时，Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描这段外源DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原间隔序列。随后，Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。最后，细菌DNA进行修复，将打开的双链缺口闭合。这就是CRISPR序列上“间隔序列”产生的过程。
Stage 2: crRNA复合物合成 ——“精确制导导弹”
在CRISPR-Cas9系统中，当入侵者到来，CRISPR序列会在“指挥官”（前导区）的调控下转录出两种“军火材料”：pre-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）和trans-acting crRNA（tracrRNA）。
pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子；tracrRNA是由CRISPR序列中重复序列区转录而成的具有“发卡结构”的RNA，随后，pre-crRNA，tracrRNA以及Cas9编码的蛋白将会组装成一个小型“兵工厂”。
它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证”（间隔序列RNA），并在RNase Ⅲ的协助下对这段目标“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区）。
crRNA、tracrRNA以及Cas9组成的复合物，就是最终的“精确制导导弹”。
Stage 3: 靶向干扰 —— 强大火力，精确打击
Cas9/tracrRNA/crRNA复合物可以对入侵者的DNA进行精确的打击。复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。
当复合物定位到目标PAM/原间隔序列的区域时，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA与互补链配对，另一条链则保持游离状态。
随后，Cas9蛋白发起猛烈攻势，其HNH核酸酶活性位点将剪切与crRNA互补的DNA单链，而其RuvC活性位点将剪切另一条非互补单链。
最终，Cas9强大的火力使目标DNA双链断裂（DSB，double-strand break），外源DNA的表达被沉默，一举歼灭入侵者。
3、如何使用CRISPR-Cas9技术？
CRISPR-Cas9是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA（gRNA，crRNA及tracrRNA的复合物）和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA，被精确剪切。
使用CRISPR-Cas9进行基因编辑也有一些限制条件。首先，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG碱基）。其次，向导RNA要与待编辑的区域的序列碱基互补配对。
CRISPR-Cas9最基础的应用是基因敲除。如果对目标基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使目标基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在的DNA损伤修复机制，会将断裂的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。
如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体DNA分子），这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，实现基因的替换或者突变。
随着研究深入，CRISPR-Cas9还可以被用于基因激活、构建疾病模型等其他方面。
CRISPR-Cas9的应用
1、用于基因治疗
在上世纪九十年代，人们已经开始利用病毒载体，把DNA以一种“缺啥补啥”的逻辑补充到基因缺陷疾病患者的体内。等到更精细的基因组编辑技术（包括ZFN锌指蛋白和TALEN蛋白）出现，人们开始看到希望，这些对基因组进行精确定位和编辑的技术，也许能够极大地完善基因疗法的技术手段。
图：传统基因疗法
传统基因疗法仅仅是把出现缺陷的DNA重新放回患者体内，至于放回的效率、数量和地点都难以控制。如果说新兴的基因组编辑技术是高精度的巡航导弹，传统的基因疗法可能最多算是大炮炮弹，有杀伤力，但是太粗放、太低效、太有破坏性。
CRISPR-Cas9技术的登场，把基因治疗的武器库升级到一种前所未有的高度：
（1）它的设计和制造极其简单，技术门槛很低（只需要设计一段几十个碱基构成的CRISPR序列）；
（2）它的打击效率非常高，可以实现一次发射、多重打击（一次基因治疗使用多个CRISPR片段，同时修改几个疾病位点）；
（3）它的打击方式更加多样化（人们已经证明，使用CRISPR-Cas9技术，可以对特定基因组位点实现删除、修复、替换等等功能）。
2、用于癌症的免疫疗法
免疫治疗是指用自身的免疫系统去治疗疾病的一类方法。通过调动患者自身抵抗力（免疫细胞）来抵御、杀死肿瘤细胞，是近年来肿瘤治疗的一个发展方向，也是当前癌症研究领域中的热点之一。目前免疫治疗大致有两种：
第一种是免疫细胞疗法。即先从患者体内抽取出T细胞，然后在体外培养。在培养过程中，用基因编辑的方法，让这些T细胞表达一些特异的肿瘤抗原受体。这可以理解为告诉T细胞，肿瘤长什么样。在体外大量增殖后，将这些经过改造的T细胞注射回患者体内继续“战斗”。此类疗法包括LAK、DC、CIK、DC-CIK、CAR-T、TCR-T、NK、CAR-NK、肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）等等。眼下有出色作用的是CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell）疗法，也就是嵌合抗原受体-T细胞疗法。
另一种是免疫检测点阻断剂药物。这些药物能使肿瘤细胞周围削弱免疫系统的信号失效，使免疫细胞不被蒙蔽，继续发起攻击。例如，使用特殊抗体与T细胞的PD-1受体结合，能阻断其接收癌细胞的削弱信号，让T细胞恢复对肿瘤细胞识别和杀伤的能力。默沙东的Keytruda（派姆单抗）和百时美施贵宝的Opdivo正属于PD-1抗体药物，Keytruda是被美国FDA批准的首个PD-1抗体药物。
CRISPR-Cas9提升CAR-T细胞疗法：
（1）生成通用型CAR-T细胞。目前，大部分的CAR-T细胞是利用患者自身的T细胞来产生。这是一个昂贵、耗时的过程。如果能够想办法生成现成的通用型CAR-T细胞，这类疗法将有望变得更便捷、更便宜。而移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）和宿主排斥依然是通用型CAR-T细胞治疗途径的主要障碍。基因编辑技术已经在一些研究中被用于克服这些障碍。
（2）增强CAR-T细胞。直接通过敲除编码T细胞CTLA-4、PD-1受体的基因，提高CAR-T细胞的功效。
Carl June教授2016年11月在Clinical Cancer Research杂志上发表的一篇论文证实，体外和动物模型研究中，经CRISPR基因编辑的CAR-T细胞表现出了强有力的抗肿瘤活性。TCR和I类HLA双重缺陷的T细胞同种异体反应性（alloreactivity）降低，且没有导致GVHD。
2016年8月，四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授研究小组率先开展了全球首个CRISPR–Cas9临床试验。虽然这一试验没有引入CAR，但利用CRISPR-Cas9敲除了来自肺癌患者T细胞的PD-1受体基因。一些类似的用PD-1敲除后的T细胞（PD1-knockout T cells）治疗前列腺癌、膀胱癌和肾细胞癌的试验也在启动中。
（3）与ZFN和TALEN等其它基因编辑技术相比，CRISPR-Cas9能够极快地测试任何新提出的基因改造思路。目前，CAR-T疗法开发者与专门从事基因编辑的公司之间已建立了大量的合作，其中包括Novartis与Intellia Therapeutics 和 Caribou Biosciences、Juno Therapeutics与Editas Medicine。未来的CAR-T疗法将受益于内源性T细胞受体基因、组织相容性基因以及信号通路组成的联合改造。不过，需要注意的一点是，通过删除这些抑制性信号提高CAR-T活性的同时，也要保证CAR-T细胞不会失控增殖。
3、最新进展
随着该项技术的发展，以CRISPR-Cas9为基础的基因编辑技术在基因治疗相关领域展示出极大的潜力，如恶性肿瘤、艾滋病以及其他多种遗传性疾病的基因治疗。下面总结基于CRISPR技术实施基因治疗的最新研究进展。
（1）成纤维细胞转化
早在2006年日本京都大学医学院山中伸弥教授就发现成年或胚胎小鼠成纤维细胞可以经转化产生能够分化为任何一种细胞类型的干细胞（IPS细胞）。这也使得他在短短六年之后获得诺贝尔奖。
最新的一项研究中，科学家运用dCas9介导的转录激活因子对特定基因组实施了表观遗传学修饰。经过修饰，成纤维细胞内可表达特定细胞的转录拷贝得到激活，近而将小鼠成纤维细胞转化为神经元细胞(Black et al., 2016)。
（2）单碱基修改
人体的大多数遗传病本质上都是由于碱基的置换和突变导致的，而之前的基因编辑技术却不能对这些点突变进行高效的校正。
最新的一项研究中，研究人员将胞嘧啶脱氨基酶与dCas9联结形成一种新型碱基编辑系统。在小鼠和人细胞系中，运用此种方法可以将胞嘧啶转变为尿嘧啶，并有可观的有效率和低错误发生率。可以说，此项研究为治疗单碱基遗传病提供了广阔的前景。(Komor et al., 2016)。
（3） HIV治疗
HIV作为一种逆转录病毒，可以将其自身的RNA逆转录为DNA并插入到宿主细胞基因组以扩增新的遗传物质和病毒。他总是和我们的CD4+T细胞很是亲近。
最新的一项研究中，研究人员利用CRISPR技术在小鼠细胞基因组中成功切除一段HIV-1 DNA序列，并且这种切除效应可在多种组织内存在。这一研究成果可以让我们直面HIV病毒复制的源头——记忆T细胞基因组上的HIV DNA片段，狠狠来上一拳。不难想象，此项技术若能联合使用抗逆转录病毒药物，必将给艾滋病的治疗带来颠覆性的改变。(Kaminski et al., 2016)。
（4）猪器官移植
对于实施猪器官移植目前面临的主要问题，是如何减少免疫排斥反应以及猪供体器官内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）的产生。
最新一项研究中，科学家利用CRISPR技术让猪胚胎中的62个PERV病毒基因陷入永久的沉睡，从而使猪供体器官（心脏瓣膜，肝脏）在人体中的移植提供了可能(Yanget al., 2015)。
（5）Anti-CRISPR蛋白的发现
虽然CRISPR-Cas9有着高效的基因编辑能力，但如何控制其对基因组的修改以及减少编辑过程中不良事件的发生，是该项技术需要完善和突破的地方。
2016年12月8日，来自多伦多大学和马萨诸塞大学的科学家们首次发现了CRISPR/Cas9的“关闭开关”（off-switches）。在这一研究中，科学家们找到了特异性抑制脑膜炎奈瑟氏球菌CRISPR-Cas9系统的anti-CRISPRs三大不同的家族。这些抑制性蛋白直接绑定了NmeCas9。此外，研究证实，这些anti-CRISPRs能够被用作人类细胞基因编辑的有效抑制剂。
2016年12月29日，Joseph Bondy-Denomy研究团队发现了由单核细胞增多性李斯特氏菌噬菌体编码的4个独特的typeII-A CRISPR-Cas抑制蛋白。其中2个抑制CRISPR-Cas9的蛋白（AcrIIA2和AcrIIA4）在大肠杆菌和人细胞中都被证实可以抑制来自酿脓链球菌的Cas9系统。（目前，来自酿脓链球菌的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛）
（6）新型CRISPR-Cpf1系统
2016年4月，来自德国的科学家发表在Nature上的文章显示Cpf1可以替代Cas9实现基因编辑，Cpf1是土拉热弗朗西丝菌（Francisellanovicida）的CRISPR结合蛋白，Cpf1蛋白是一种比Cas9蛋白更小而且更简单的核酸内切酶 ，具有双重切割活性：不仅切割DNA，而且也切割RNA。Cpf1能够独自对pre-crRNA进行加工，然后利用加工后产生的crRNA特异性地靶向和切割DNA，这是人们迄今为止发现的一种最简单的CRISPR免疫系统。
2016年12月5日，张锋等科学家发现，CRISPR–Cpf1还可以打造多重基因编辑系统。毫无疑问，Cpf1这个新人有望成为替代Cas9的一种新型切割工具酶。
CRISPR的相关企业
1、三家上市公司
Editas Medicine，由哈佛大学教授George Church与博德实验室的张锋则联手创立，成立于2013年。计划于今年开展CRISPR基因编辑治疗利伯先天性黑朦病（Leber congenital amaurosis，LCA；一种遗传性视力衰退疾病）的人体实验，并与Juno合作开展的癌症CAR-T治疗项目，以及良性血液疾病、遗传性肌肉疾病、遗传性肺病、遗传性和感染性肝病等。
2016年2月3日，Editas Medicine在NASDAQ上市，股票代码：EDIT。
Intellia Therapeutics，由加州大学伯克利分校的杜德纳参与设立，成立于2014年。2015年1月，公司与CAR-T领域处于领先地位的诺华展开一项长达5年的研发合作计划，共同利用CRISPR基因编辑技术研究造血干细胞相关的疾病，包括镰状细胞病、β-地中海贫血等，致力于加速发展CRISPR-Cas9技术在CAR-T细胞治疗和造血干细胞中的应用。2016年4月11日，与Regeneron达成为期6年的CRISPR基因编辑疗法合作开发协议。
2016年5月6日，Intellia Therapeutics在NASDAQ上市，股票代码：NTLA。
CRISPR Therapeutics，由卡彭蒂耶参与设立，总部位于瑞士巴塞尔。2015年10月，福泰制药（Vertex）宣布与CRISPR Therapeutics签约四年，合作开发针对已经有人类基因确证靶点的CRISPR-Cas9药物，主要针对囊肿性肺纤维化和镰刀型贫血症。
2015年12月，拜耳计划在未来五年内注资3亿美元，与CRISPR Therapeutics共建合资公司，依托CRISPR-Cas9和Bayer精湛的工程蛋白技术，研发突破性疗法，以期治愈血友病、失明以及先天性心脏病等。
2016年10月19日，CRISPR Therapeutics在NASDAQ上市，股票代码：CRSP。
2、新兴企业
Synthego由前SpaceX工程师Paul Dabrowski和Michael Dabrowski兄弟二人于2012年创立，是一家基因组工程解决方案的领先提供商。公司的旗舰产品CRISPR evolution是一个为CRISPR基因组编辑和研究设计的合成RNA组合，以提高研究的速度、降低成本。
当前所有投资者：Founders Fund、Menlo Ventures、8VC、Alexandria Real Estate Ventures、AME Cloud Ventures、Jennifer Doudna。
披露的总融资金额：三轮融资共计获得4980万美元
Caribou Biosciences成立于2011年，致力于利用CRISPR-Cas9系统在疾病治疗、农业、研究和工业领域开发新型生物技术。公司的CRISPR核心技术来自加利福尼亚大学和维也纳大学，联合创始人是Intellia Therapeutics公司的Jennifer Doudna。
当前所有投资者：Novartis Venture Funds、F-Prime Capital、5 Prime Ventures、Mission Bay Capital、Maverick Ventures
披露的总融资金额：三轮融资共计获得4150万美元
eGenesis由哈佛大学George Church教授和青年华人科学家杨璐菡于2014年联合创立。致力于利用CRISPR技术为全球十万患者提供安全、有效的人体移植细胞、组织和器官。公司正在开发可供人类器官移植使用的转基因猪。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术尽可能地去除特异性的猪基因，以使猪器官安全移植到人体内。
当前所有投资者：Khosla Ventures、Biomatics Capital Partners、ARCH Venture Partners、Alta Partners
披露的总融资金额：二轮融资共计4000万美元
伦理争议
2015年3月，哈佛大学教授George Church实验室尝试在未成熟的人类卵细胞中利用CRISPR基因编辑技术，纠正BRCA1基因突变。一石激起千层浪，一周之内《Science》和《Nature》杂志纷纷发文，警告类似基因编辑操作存在未知的安全和伦理风险，呼吁停止利用类似技术对人类生殖细胞进行编辑。
一波未平一波又起，2015年4月18日，来自中山大学黄军就实验室的一篇学术论文（发表于《Protein&Cell》）再次引发争议：他们在人类胚胎中进行了基于CRISPR技术的基因编辑操作。尽管黄声称实验所用的是本身存在缺陷、无法发育成成熟胚胎的受精卵，但是在很多批评者看来，类似操作已经与人工修改和制造人类本身无异。
2017年3月1日，广州医科大学附属第三医院刘见桥教授团队在《Molecular Genetics and Genomics》杂志上发表文章，研究团队首次利用CRISPR-Cas9技术在可存活（viable）的人胚胎中进行基因编辑。这是全球首次将基因编辑技术运用于人类正常胚胎，对携带遗传突变基因的胚胎进行修复。争议愈发激烈。
展望未来
在21世纪开头十几年，我们正在亲历以ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9技术为代表的基因编辑技术腾飞带来的变革。人类改造自身遗传信息的门槛将迅速降低。
不管人们的态度是恐惧、抵触、欢迎或者漫不经心，人类在进化了数百万年的之后，的确已经处在大规模改造乃至创造自身的前夕。
在这个载入史册的关口，与其试图用道德观念和伦理批判来延缓技术进步，不如用更开放的心态去欢迎，制定严格的监管制度来管控，让新技术在自身进化成熟之后，帮助人类更好地认识和完善自己。
内容：部分来自“以负熵为生”、“ScienceLondon未止科技”、“象物”等公众号文章及基因技术领域相关报道。
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