《Cell》子刊：优化Cas9特异性新思路
来源：转化医学网
科学家们通常利用RNA引导Cas9核酸酶在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割、修饰。但是，Cas9的脱靶效应严重阻碍了其应用。然而最近的一项研究揭示了HNH核酸酶结构域与PAM远端的RNA / DNA异源双链体之间的远程变构通讯，并以此作为校对检查点来控制Cas9的核酸酶活性和特异性。
研究者应用单分子FRET（smFRET）来直接表征个别化脓链球菌Cas9的构象动力学。研究表明，Cas9自发波动于三个构象状态之间，其伴随着显着的催化HNH域的运动。此外，研究者通过引入sgRNA与靶DNA链之间的错配，靶与非靶DNA链之间的错配以及Cas9残基上的突变来检查Cas9的动态如何受到影响。
研究结果表明，Cas9通过PAM-远端与其催化HNH结构域之间的长程变构通讯使用校对机制。在PAM远端的几个Cas9残基和RNA / DNA异源双链之间的相互作用触发Cas9以短暂地取样其“切割有能力”的闭合状态以介导DNA切割，而sgRNA和DNA之间的4个或更多个不匹配导致HNH结构域和暂时形成的“裂解受损”闭合状态。
该研究结果提供了了解Cas9的构象动力学和Cas9与RNA / DNA异源双链之间的相互作用如何决定其核酸酶活性和靶特异性的基本分子概述。最后，研究者提出一个替通过突变参与校对步骤的残基来提高Cas9特异性的替代方法。
1.Cas-9动态行为
Cas9介导的DNA识别和切割是高度动态的多步骤过程，包括sgRNA结合、目标搜索、RNA链入侵、R环扩增和DNA切割。本研究的主要焦点是Cas9的构象动力学如何在Cas9稳定结合于DNA靶点后对其进行DNA切割。
Cas9的几种不同的结构构象已经通过结构研究而被观察到。在这里，研究者直接捕获了Cas9在三个主要全局构象状态之间自发转换，即使它结合完全互补的靶DNA，这反映了催化性HNH结构域的显着动态运动。高速原子力显微镜（AFM）也可以实时观察Cas9与DNA结合后HNH结构域的波动情况。该研究结果表明，HNH结构域的局部构象可以通过远距离变构通讯在PAM远端形成sgRNA / DNA异源双链进一步调节。
另外，之前的smFRET研究已经揭示，完全匹配的sgRNA / DNA异源双链体在其PAMdistal末端也自发地在压缩和解链构象之间转换，其提供了这种构象灵活性，这提供了HNH结构域的局部构象灵活性更直接的证据表明Cas9 / sgRNA / DNA复合物采用两个或多个动态构象状态而不是稳定的静态结构。
总之，这些结果毫无疑义地证明了整体水平和局部上的Cas9 / sgRNA / DNA复合物的高度构象动态性质。
Cas9治理DNA裂解的构象动力学
2.Cas-9高保真机制
在所有情况下，Cas9的封闭构象状态最少。在催化位点朝向其靶位点的正确位置上的短暂停留在裂解能够闭合的状态下，这足以使Cas9切割其靶DNA链。类似的分子行为已经被发现并被认为是在延伸和DNA复制的氨酰-tRNA选择期间达到高保真度的分子机制，在此期间核糖体/氨酰基tRNA /延伸因子Tu复合物和DNA聚合酶已经显示出分别在非活性状态和活性状态之间波动。研究提示Cas9采用类似的分子机制来实现其高特异性。有裂解能力的闭合状态的稳定性已经发展成不如其他非活性状态稳定。
因此，只有正确的DNA靶标才能瞬间引发朝着能够切割的状态采样以完成切割，而含有错配的DNA目标不太可能或者完全不能导致这种瞬时采样。 Cas9和DNA之间相互作用减弱或加强的事实导致Cas9特异性增强或降低，同时伴随分裂能力状态的减少或增加。总之，非活性状态和活性状态之间的良好构象动力学是Cas9实现其高特异性的基本分子机制。
3.Cas-9的校对机制
Cas9的全局结构构象是高度动态的，并且在三个主要构象状态之间自发地波动，主要反映开放，中间和封闭状态中HNH结构域的构象动力学。由于HNH结构域和PAM远端区域之间的长程变构通讯，含有3个或更少错配的RNA / DNA异源双链体触发HNH结构域的局部运动，以正确定位其催化位点以形成能切割的封闭Cas9状态，而4个或更多个错配导致HNH结构域的相似但不正确的局部位置，导致裂解受损的封闭的Cas9状态。
研究者推测Cas9呈现独特的校对机制以确保sgRNA和DNA之间的互补性，通过感测压缩的异源双链体（3个或更少的错配）在PAM上的Cas9结合后通过PAM识别和异源双链形成邻近PAM。 Cas9的REC3和RuvC-III结构域与PAM远端的拉链异源双链之间的相互作用允许Cas9通过校对步骤（最后一个检查点），触发短暂形成有切割能力的闭合状态，并允许DNA切割。
结果还表明，REC3域参与感知异源双链体形成，并且在校对期间REC2域介导REC3和HNH域之间的长程变构通讯。可以通过修改参与校正步骤的REC3和RuvC-III结构域中的残基来设计具有增强的特异性的新Cas9变体，特别是对于PAM-远端。可以通过减弱相互作用来创建几个高保真性变体REC3和异源双链之间。总之，此研究结果表明，Cas9的多个层次的全局和局部构象动力学相互作用来控制其核酸酶活性和特异性。
参考文献：
Mengyi Yang, Sijia Peng, Ruirui Sun,Jingdi Lin, Nan Wang, Chunlai Chen. The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET.
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.048
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