Cell Rep：解释为何CRISPR-Cas9存在脱靶效应
来源：生物谷
Cas9蛋白的发现简化了基因编辑，甚至可能在不远的将来消除很多遗传性疾病。利用Cas9，科学家们能够切割细胞中的DNA，从而校正发生突变的基因，或者将新的遗传物质导入到这个新被切开的位点上。最初，CRISPR-Cas9系统似乎是非常准确的。然而，如今，显而易见的是，Cas9有时也切割与它靶向的序列相类似的其他DNA序列。在一项新的研究中，来自荷兰代尔夫特理工大学的研究人员开发出一种数学模型来解释为何Cas9会切割一些DNA序列，同时又让其他的DNA序列保持完整。相关研究结果发表在近期的Cell Reports期刊上，论文标题为“Hybridization Kinetics Explains CRISPR-Cas Off-Targeting Rules”。
CRISPR-Cas9系统是一种保护细菌免受病毒侵害的防御机制。如果病毒侵入细菌中但不接管这个细菌细胞，那么这种防御系统将从病毒中切掉一些遗传物质并将它储存在这个细菌自身的基因组中。这种内置的病毒DNA起着遗传记忆的作用。如果这种相同的病毒再次攻击这个细菌（或它的后代），那么它会快速地识别这种发起攻击的病毒，并且派送Cas9蛋白来追踪它。利用这种储存的遗传物质产生的病毒RNA （CRISPR RNA, crRNA）作为一种“速查表（cheat sheet）”，Cas9寻找这个细菌细胞中的不友好的DNA。如果发现匹配的病毒DNA，那么CRISPR-Cas9系统会切割这个病毒DNA，从而消除病毒再次入侵的威胁。
有害的影响
科学家们最初认为CRISPR-Cas9若要切割一段DNA序列，那么这段DNA序列就应与它携带的速查表完全匹配。但是，这种猜测如今已被证实是错误的。Cas9有时会切割与它正在寻找的靶DNA相类似的DNA序列，但是这些相类似的DNA序列含有多个不同的碱基。根据代尔夫特理工大学研究员Martin Depken的说法，从进化的角度来看，切割这些稍微不同的DNA序列是非常合理的。他说，“病毒不断发生变异，因而能够具有不同于Cas9寻找的靶标的基因组成。通过也切割略有不同的DNA序列，CRISPR-Cas9系统能够跟踪病毒的进化和更好地保护这个细菌免受它的攻击者的攻击。”
在这种情况下，这对细菌是有益的，但是对人类却是有害的。如果我们想要利用Cas9编辑基因，那么除了切割研究人员想要靶向的基因之外，其他的基因不会被切割是非常有必要的。摧毁其他的遗传物质能够产生可怕的后果。
已有实验表明相比于其他的基因编辑工具，CRISPR-Cas9更可能切割某些不匹配的序列。
由博士生Misha Klein领衔的Depken团队想要知道决定这种偏好的基本物理学是什么。Depken说，这一切都是关于进行背离RNA模板的碱基配对所耗费的能量。
Depken解释道，“当Cas9查验一种DNA序列是否匹配时，它从这条链的一端开始查验。 随后，它会依次查验这条链中的所有碱基。对于每个碱基匹配，Cas9都会获得能量，而任何不匹配都会消耗能量。一种DNA序列包含的不匹配的碱基越多，并且这些不匹配的碱基越接近这种序列的开始处，Cas9就越不可能对它进行切割，相反，它将从DNA中脱落下来并继续寻找一段能够更好地匹配它的RNA模板的DNA序列。
更好的预测
根据Depken的说法，令人吃惊的是，他的团队开发的这种简单数学模型非常好地预测了现有的关于Cas9切割行为的数据。如果不匹配的碱基位于一段DNA序列的末尾，那么为了增加切割的可能性，Cas9可能需要汇聚足够的能量来克服这一障碍。该模型还解释了当Cas9在一段DNA序列的起始处遇到不匹配的碱基，或者两个不匹配的碱基挨得很近时，它为何不能对这段DNA序列进行切割。
当谈及一段DNA序列被切割的可能性时，Cas9蛋白本身的物理性质也起作用。Depken和他的同事们如今正在考虑将这个变量整合到他们的模型中。最终，这种模型应该能够更好地预测Cas9可能产生的切割错误。Depken说，“有时，在修复基因时，要选择精确的位点进行切割，而且我们的模型将有助于确定靶向哪些位点是最合适的。”这种模型提供的物理理解也有助于在编辑DNA时避免发生危及生命的错误。
参考资料：
Misha Klein, Behrouz Eslami-Mossallam, Dylan Gonzalez Arroyo et al. Hybridization Kinetics Explains CRISPR-Cas Off-Targeting Rules. Cell Reports, 6 February 2018, 22(6):1413–1423, doi:10.1016/j.celrep.2018.01.045
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