《Nature》重磅！哈佛著名华裔科学家再度开发出革命性基因编辑工具！
来源：医学转化平台
今天，顶级学术期刊《自然》杂志在线发表了一篇来自哈佛大学的重磅文章，著名华人科学家、2017年度Nature十大人物入选者哈佛大学David Liu教授团队基于spCas9开发出一种叫做xCas9的新型基因编辑工具酶，其不再受限于以往spCas9基因编辑必须的PAM序列NGG，即便PAM序列为NG、GAA或者GAT，xCas9照样能够进行基因编辑，这使得xCas9能够直接靶向四分之一的人类基因组序列，这项技术极大地拓宽了基因编辑的应用范围。
哈佛大学著名华人科学家David Liu教授最近相当火爆，经常有CNS级别的文章发表，又入选十大人物、十大进展等等，风头竟一度盖过CRISPR基因编辑技术的张锋、杜德拉等了。
▲Broad研究所的David Liu教授团队在《自然》上面发表的文章（图片来自Nature）
在这篇《自然》杂志在线发表的重磅文章中，著名华人科学家、2017年度Nature十大人物入选者哈佛大学David Liu教授团队基于spCas9开发出一种叫做xCas9的新型基因编辑工具酶，其不再受限于以往spCas9基因编辑必须的PAM序列NGG，即便PAM序列为NG、GAA或者GAT，xCas9照样能够进行基因编辑，这使得xCas9能够直接靶向四分之一的人类基因组序列，这项技术极大地拓宽了基因编辑的应用范围【1】。
同时，《Nature》还配发了一篇题为：“Powerful enzyme could make CRISPR gene-editingmore versatile”的评论文章，给与了这项工作高度评价【2】。
▶学霸David Liu◀
粗略翻看David Liu教授的简历，可以说绝对是学霸级别的，1973年在加州出生的他，读高中就拿第一名，然后就上了哈佛大学读化学，几年之后，又以第一名的成绩从哈佛大学毕业，去了加州大学伯克利分校（UC Berkeley）顺利完成博士学位（1999年），然后连博士后都没干，直接在1999年就接着升任哈佛大学助教，然后一路前进，2003年坐上了副教授位置，2005年就成了全职教授了，这就是坐火箭一般的速度啊！
▲高中时期的David R. Liu
不得不佩服啊，连博士后都没有干过，就当了教授了！
看看干博后的人，一把酸辛一把泪地做牛做马，好不容易熬出头，结果，找助教找不到，更别提要把板凳坐穿的副教授位置了，教授就更别想了，熬到教授位置恐怕早已经白发苍苍了！所以说牛人的道路自然是与众不同的！
▲David R. Liu教授
David Liu在三十几岁就当了哈佛正教授，不得不说还是相当厉害的，而三十几岁，大多数科学家还在博后位置上做牛做马，也不知道是哪个龟儿子发明的博士后这么一种上不上、下不下的职位，活脱脱地把一个年轻有为的人往后拖个三五年再上岗，完全是拉慢了人类攀登科学高峰的速度（开个玩笑哈）。不过，话又说回来，人人都去争当做教授，那谁又来当小兵在实验室干活呢？总不能让白发苍苍的老爷子们在实验室来亲手捣鼓瓶瓶罐罐吧！
▶定向进化◀
人类有时候真的是过于聪明了，极其善于利用其它物种的各种优势来为己所用，当然，这可能也是人类统治地球的原因，你比如要是老虎、狮子都比人类聪明，那人类早就灭亡了。
目前生活在地球上的各个物种，以及各个物种的细胞、分子等等都是经历过成百上千年、甚至上亿年的进化而来。比如细菌，几亿年前在地球上就存在了，到现在，已经进化了上亿年，才能够适应现在的各种生存条件。
在自然条件下，进化是相当缓慢的一个过程。
聪明如人类一般，自然就会想：能不能加快物种的进化速度？比如细菌或者噬菌体？
为何要加快物种的进化？或者加快物种进化有什么用？如上面所说，这自然是为了人类自身的利益，把其它物种的优势拿来为己所用。
因此，人类发明了一种叫做定向进化（directed evolution）的技术，来迅速加快物种尤其是微生物的进化速度，并且按照设计的进化方向进行进化，最终得到想要的微生物或者分子。
▲一种定向进化技术的示意图，主要是在人工条件下采用突变或重组的方式模拟自然进化过程（图片来自网络）
定向进化怎么做？
无他，只不过是在人为环境下模拟自然进化而已。试想一下，物种进化的根本动力是什么？是基因突变！因此，定向进化就是模拟进化过程，通过随机突变和重组，人为制造大量的突变，按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质，实现分子水平的模拟进化。
这是目前改善蛋白质性能最有效的方法之一，可在未知目标蛋白质结构信息和作用机制的情况下对蛋白质进行快速改造。
▶拨弄定向进化的高手◀
而David Liu教授正是一位拨弄定向进化技术的顶尖高手！
▲David Liu研究团队在2011年开发的一种叫做噬菌体辅助持续进化（phage-assisted continuous evolution，PACE）定向进化技术（图片来自Nature）
早在2011，David Liu研究团队就在著名学术期刊《Nature》杂志上面发表一篇文章，介绍了一种叫做噬菌体辅助持续进化（phage-assisted continuous evolution，PACE）定向进化技术。
这项PACE技术通过让生物分子的实验室进化和一种噬菌体的生命周期结合在一起，让蛋白质在每24小时内进化60轮。PACE的效率是传统实验室进化方法的100倍左右，整个实验过程也无需人为干预，大大节省了科学家的劳动成本。当时文章一经发表就引起了广泛的关注。
▲David Liu研究团队在2011年开发的PACE技术的原理（图片来自Nature）
▶Cas9的致命弱点◀
要了解David Liu的这篇《Nature》文章的重要意义，就必须要知道Cas9蛋白质的致命弱点。
Cas9蛋白的致命弱点是什么呢？
一种叫做“PAM”的东西！
PAM是protospacer adjacent motif的首字母简写，CRISPR-Cas蛋白要发挥剪切基因组的作用，除了sgRNA用于定位之外，一小段特定的PAM序列也是必不可少，每一种Cas9酶的PAM序列是不同的（见下图）。比如spCas9（来源于酿脓链球菌Streptococcuspyogenes），其PAM序列为NGG（N代表任何核苷酸，G表示鸟嘌呤分子），SaCas9（来源于金黄色葡萄球菌staphylococcusaureus）的PAM序列为NNGRRT。
▲各种不同的Cas9蛋白的PAM序列（蓝色碱基）以及剪切位点（红色箭头），值得注意的是，表格中最下面一排，KKH SaCas9也是通过一种定向进化技术得来的【4，5】
因此，特定的PAM序列决定了Cas9蛋白剪切基因组的范围，比如spCas9的PAM序列为NGG，故而spCas9剪切位置只能在NGG附近。然而，关键的问题是，基因组中又有多少序列是NGG呢？
人类基因组32亿碱基对中大约仅十六分之一有这个NGG序列，“这真是一个大限制条件，”David Liu教授说到。
因此，要想让Cas9的应用范围更加广泛，一方面可以寻找PAM序列不同的Cas9，另一方面，也许可以改造Cas9蛋白，使之能够识别不同的PAM序列。
▶新型基因编辑酶xCas9◀
改造蛋白，这正是David R. Liu教授最拿手的事情！
没想到的是，时隔多年之后，David R. Liu团队的这项定向进化技术PACE竟然在这篇2月28日在线发表的《Nature》文章中发挥了关键作用。
抛开繁琐的筛选过程，来看看结果。
研究者们将筛选到的新型Cas9叫做xCas9，其中，又分成多个亚型，xCas9不再受限于以往spCas9基因编辑必须的PAM序列NGG，即便PAM序列为NG、GAA或者GAT，照样能够进行基因编辑。
▲各种不同的亚型的xCas9蛋白与SpCas9的关键蛋白质位点的比较（图片来自Nature）
其中，xCas9 3.7除了能够胜任PAM序列为NGG之外，对于NG、NNG、GAA、GAT以及 CAA这些PAM序列也能够完全胜任。
并且，研究者们将xCas9成功应用于转录激活，基因敲出及单碱基编辑。而且研究表明，虽然应用范围扩大了，但其特异性反而要高于传统的SpCas9。
这项研究的重要意义在于，人们通常情况下认为，作为细菌天然免疫策略的Cas9，在DNA特异性结合位点（PAM序列）识别方面非常保守。“PAM结合像是一个守门人，如果守门人喝醉了，Cas9就会失控的开始狂欢，搞砸打靶任务，”David Liu教授解释道。
然而，这篇文章的结果却让所有人出乎意料。“如果你问我为什么会这样，回答是，我也不知道它的确切机理，”David Liu接着说道。
坦福大学的华人科学家齐磊（Stanley Qi）称赞这项工作时使用“耀眼”来形容。“真正的考验是，其他人是否愿意用xCas9s代替老版本，”齐磊说到，“至少在我的实验室，我非常渴望用它做出新的应用尝试。”
参考资料：
1. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibilityand high DNA specificity.
2. Powerful enzyme could make CRISPRgene-editing more versatile.
3. A system for the continuous directedevolution of biomolecules.2011.
4. Broadening the targeting range ofStaphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition.2015.
5. CRISPR-Based Technologies for theManipulation of Eukaryotic Genomes.2017.
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