亨廷顿病基因治疗进展与挑战
来源：重庆医科大学学报
裴中，吴腾腾
中山大学附属第一医院神经科
【摘 要】亨廷顿病是一种常染色体显性遗传病，基因治疗是控制病情进展甚至实现根治的有效手段。随着反义核苷酸疗法在亨廷顿病基因治疗中获得初步成功，针对基因组水平及mRNA水平的各项技术也正在积极开发、改良，在不久的将来相继开展临床试验。本文围绕亨廷顿病基因治疗的现状、发展方向及临床挑战，开展相关研究状况的综述。
【 关键词 】亨廷顿病；基因治疗；反义寡核苷酸；基因编辑
裴中，吴腾腾. 亨廷顿病基因治疗的进展与挑战[J]. 重庆医科大学学报，2019，44（4）:520-525.
亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）又称慢性进行性舞蹈病、大舞蹈病，患者一般在中年发病，出现运动、认知和精神方面的症状。患者病情呈进行性恶化，通常在发病15~20年后死亡。HD是一个常染色体显性遗传病，子女的发病概率为50%。病因是由于亨廷顿基因（HTT）第一号外显子上的CAG三联密码子重复序列异常扩增所致。拥有多于36次CAG重复三联密码子的个体可能患病，如果重复次数为36~39次，个体表现不完全外显，部分携带者可不发病或推迟发病；当CAG重复次数≥40次时，个体则表现出完全外显，所有携带个体均可发病[1]。由于HD是由于基因突变所致，所以最根本的治疗是基因疗法。目前包括直接在DNA水平纠正亨廷顿基因突变的基因编辑及在mRNA水平抑制变异的HTT蛋白(mutant huntinatin,mHTT)的生成的mHTT蛋白降低（HTT lowering）。针对HD的基因治疗，科学家尝试了不同的策略，其中包括反义寡核苷酸、RNA干扰、小分子化合物、锌指蛋白以及CRISPR基因编辑技术[2]。在2015年，反义寡核苷酸（antisense oligonuclectide, ASO）首次进入临床试验，初步结果发现ASO明显降低HD患者脑脊液毒性蛋白mHTT，病人对ASO有良好的耐受性，证实了其良好的安全性。但ASO是否能减缓疾病的进展，尚有待进一步大规模临床试验。而以CRISPR为代表的新技术还处于实验室研究阶段。本文将就HD基因治疗的现状、发展方向及临床挑战作简要综述。
（1）以IONIS-HTT Rx为代表的ASO，能够在细胞核内与mRNA前体碱基互补配对，诱导RNaseH降解目的mRNA前体
（2）根据SNP设计的ASO倾向于与突变基因的mRNA前体碱基互补配对，选择性降解突变mRNA前体
（3）小分子化合物直接干扰mRNA前体剪接形成成熟mRNA
（4）siRNA在体内组装成RISC，非选择性的与HTT成熟RNA结合，诱导其降解
（5）等位基因特异性的siRNA倾向于与突变HTT的成熟RNA碱基互补配对，选择性降解突变HTT成熟RNA
图1. 非等位基因特异性及等位基因特异性 mHTT降低疗法
1.1 针对毒性蛋白HTT的基因治疗
HTT蛋白（huntingtin，HTT）是亨廷顿基因（HTT）的编码产物。目前HTT的正常功能尚不明了，但突变亨廷顿基因可产生变异的HTT蛋白(mHTT)，最终导致蛋白聚集形成包涵体[3]。mHTT具有神经毒性，是引起HD病理生理改变的主要原因。理论上抑制mHTT的生成或促进其降解，都可使mHTT蛋白降低，达到治疗目的。但实际上，就mHTT蛋白降低效率而言，抑制mHTT的生成要远高于促进降解。
如所有基因指导蛋白质合成一样，mHTT的生成也包括从DNA到mRNA的转录及从mRNA到蛋白质合成的翻译过程。由于mRNA缺乏自我修复机制，因此通过干扰或者阻止mRNA的翻译，可以抑制mHTT的生成，从而达到降低脑组织中mHTT的目的。目前，相关的在研治疗策略主要有以下3种：反义寡核苷酸、RNA干扰以及调控mRNA剪接的小分子化合物。
1.1.1 ASO疗法 ASO是人工合成的单链DNA或RNA，能够与mRNA结合，诱导其被核糖核酸酶H（RNase H）降解（见图1）。迄今为止，已经相继研发上市了三代ASO。通过对其分子结构进行化学修饰，第三代ASO的核酸酶抗性以及mRNA亲和性，较前两代有了明显提高。在大大增强疗效的同时，减轻了相应的非特异毒副作用（肝脾损害、凝血功能、免疫刺激等）[4]。目前，用于HD临床试验的ASO，是经过2'-O-MOE修饰后的靶向人源HTT mRNA的第二代反义寡核苷酸IONIS-HTTRx。I期临床试验结果表明，早期HD患者经过为期3~4个月，每月1次的鞘内给药，并未报告严重不良反应，说明早期HD患者对于IONIS-HTTRx的耐受性良好[5]。此外，临床结局表明，IONIS-HTTRx能够降低HD患者脑脊液中mHTT的含量，且呈浓度相关性。脑脊液mHTT降低程度与部分认知、运动相关量表的评分改善相关，可能提示临床获益[31]。但是，更加完善的设计以及更加充足的样本量是后续临床验证必不可少的环节。相关的三期临床试验将在2019年初在全球超过80个中心开展，预计入组660名症状期HD患者，随访超过25个月，通过临床量表、生物标志物、智能设备评估等多个维度进一步评价ASO治疗对于疾病进程的影响[6]。
然而ASO是否能够改善临床症状仍值得关注，因为鞘内注射ASO到达深部脑组织的量可能很有限，而纹状体神经元死亡是导致运动症状的主要原因。在猴模型中发现，鞘内注射IONIS-HTTRx能有效地降低皮层的HTT表达量（约50%），而在纹状体仅能降低约20%的HTT表达[9]。可能是由于ASO主要通过局部扩散进入脑组织，而扩散深度介于1-2mm,所以导致位置浅表的皮层药物疗效较深在的纹状体高[10]。然而众多研究确实观察到广泛的ASO表达，提示可能存在其他药物扩散的途径。这值得进一步研究。
优化ASO药物递送方式是解决目前ASO脑区间疗效不均一的可能方向。目前通过共价缀合某些多肽或小分子，已能够实现ASO靶向BBB上相应受体，增强其透过能力，从而使得ASO能够随着血流在全脑范围内分布。例如，在脊髓性肌肉萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）小鼠模型中，静脉注射多肽修饰的ASO，能够减轻SMA小鼠的运动障碍，延长其存活时间[11]。这项技术还有待进一步在HD中加以验证。
1.1.2 RNA干扰 RNA干扰（RNA interference，RNAi）通过向细胞中引入特定序列的RNA，包括siRNA(short interfering RNA，siRNA)、shRNA (short hairpin RNA， shRNA)以及miRNA（microRNA, miRNA)，在细胞中形成核糖核酸酶沉默复合物RISC（RNA-induced silencing complex, RISC)，进而与特定序列mRNA的互补结合，诱导其降解，最终[12]（见图1）。由于这类双链结构的RNA在脑组织中的扩散范围相对局限，通常需要依靠载体进入脑组织，目前多通过脑内定位注射病毒载体实现RNA干扰。通过病毒转染，外源序列能够在目的细胞中长期稳定表达，使细胞自行生产shRNA/miRNA等siRNA的前体成分。
目前uniQure公司开发的AMT-130即将进入临床试验。AMT-130是以AAV5为载体，通过miRNA实现RNA干扰的基因疗法。相较于IONIS-HTTRx，AMT-130也是靶向人源HTT mRNA，但通过手术定位注射于纹状体，因此对纹状体mHTT的抑制效果更佳，能够显著减少纹状体mHTT的聚集以及神经元死亡，而且单次给药后疗效维持时间长，可长达1年以上[13, 14]。然而缺点是，目前病毒递送需要外科手术辅助，一旦出现由于病毒载体以及外源序列所导致的不良反应，目前缺乏有效的应对措施，存在一定的风险。
受限于病毒安全性问题、有限的治疗范围、外科手术给药等问题，RNAi在HD基因治疗领域中进展较慢。因此，针对该种治疗策略，其优化方向则是研发安全性更强、转染效率更高、转染区域更广的病毒载体。近年来，随着各类新型病毒载体的研发，病毒的扩散性能以及BBB穿透能力都有了显著提高，使得多脑区干预以及静脉用药成为可能[16]。
为了规避病毒载体以及外源序列副作用等问题，利用脂质体、外泌体等针对BBB的药物载体[17]，实现短效RNA干扰，在未来HD基因治疗中也具有可观的潜在应用前景。本课题组与南京大学生科院共同合作，验证装载siRNA的外泌体在HD的治疗效果。通过静脉注射，装载siRNA的外泌体能够穿越血脑屏障，靶向神经元实现RNA干扰。该外泌体能够降低小鼠模型mHTT的表达以及挽救运动表型[18]。
1.1.3 等位基因特异性治疗 HD患者多为杂合突变，即携带有一个具有正常功能的HTT基因（wtHTT）以及一个突变的HTT基因（mHTT）。而目前的基因治疗策略大部分靶向wtHTT和mHTT基因的共有序列，因此在降低mHTT的同时，也降低了wtHTT。虽然wtHTT目前的功能不清，但完全缺失wtHTT会导致发育障碍，因此同时降低mHTT及wtHTT存在潜在的危险[7]。相比之下，只针对mHTT的精准治疗可以减少这种风险。因此开发等位基因特异性的基因治疗将是未来发展的趋势。
一对等位基因之间的序列并不是完全一致的，存在着众多单个核苷酸的变异。由这种单个核苷酸变异在基因组层面导致的多态性称为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）。针对仅位于mHTT基因上单个SNP位点设计药物[8]，能够在降低mHTT的同时，维持wtHTT的表达（见图1）。WAVE公司设计新一代的ASO，能够分别识别2个在mHTT存在的高频SNP变异，从而选择性降低mHTT的表达，预计约2/3的HD患者适用该类药物[32]。目前在欧洲、加拿大和美国的HD患者中测试这2种ASOs的安全性[8]。
与IONIS-HTTRx相同，AMT-130也是靶向wtHTT 和mHTT的共有序列。相较于ASO的个体化治疗，RNA干扰的个体化治疗进展较慢。主要原因是RNA干扰靶向的是成熟的mRNA,成熟的mRNA只体现外显子序列，因此只能针对位于外显子区域的SNP开发相应的治疗策略，然而位于外显子区域SNP远少于位于内含子区域。目前仅报道了针对位于外显子的SNP位点rs362331 设计miRNA能够实现等位基因特异性RNA干扰。如果针对该位点开发新疗法，预计能够覆盖49%的HD患者[15]。
等位基因特异性治疗需要HD人群中杂合度较高的，且能够被靶向的SNP位点。随着未来基因检测技术的发展，我们对于HD致病基因序列有更加全面的了解，从而获得更多高频的候选位点。而该位点是否能够被靶向，一方面取决于该位点的变异类型及周边序列，另一方面取决于药物对于靶向序列微小差异的识别能力，其中后者是可以通过优化药物组成和结构等方式实现。
1.1.4 调控mRNA剪接的小分子化合物 小分子化合物是另一类实现靶向HTT RNA治疗的潜在新型药物。该药为口服剂型，体内吸收后能够穿过血脑屏障到达脑内。这类药物主要通过诱导pre-mRNA的错误剪接和降解，（见图1）。其中，不同构象的药物可以靶向不同的剪接机制，从而干扰特定pre-mRNA的剪接。例如，Naryshkin等[19]发现了一类小分子能够改变SMN2 pre-mRNA的剪接，进而诱导有功能的SMN蛋白的表达，其机制与治疗SMA的ASO类药物Spinraza大致相同。目前在SMA领域中已有1项I期试验完成。在HD治疗领域，类似的工作也正在进行，现已经筛选出能够降低HTT mRNA的先导化合物，经过进一步优化，有望在2020年开展临床安全性试验[33]。
不过，值得注意的是，虽然口服用药可能是实现基因治疗的最佳目标，但是还有很多障碍需要克服。例如，脱靶效应就是这类药物亟待明确的问题。不同于ASO以及RNAi等治疗药物，该类药物并非基于碱基互补配对的靶向机制，而是直接干扰了一类RNA的剪接过程，因此对其脱靶效应需要更加警惕。
1.2 DNA水平的基因编辑纠正治疗
HD是一种单基因遗传病，因此，直接纠正基因组DNA致病突变或删除突变基因，无疑是治疗疾病的最佳选择。CRISPR/Cas9基因编辑技术为实现这一治疗提供了可能。例如，李晓江课题组通过病毒载体局部注射的方法，利用CRISPR/Cas9编辑系统使小鼠纹状体突变的等位基因失活，从而显著降低了HD小鼠纹状体局部的mHTT的表达，减轻了相关的病理改变及运动障碍表型，且没有观察到明显的脱靶效应[20]。但是HD基因编辑仍处于实验室阶段，还有几个重要的问题需要解决：时机的选择；等位基因特异编辑；脱靶效应。
由于HTT在机体生长发育中十分重要，因此在什么时候对HTT进行编辑是目前最关心的问题。研究发现在2月龄、4月龄、8月龄小鼠完全敲除HTT将分别导致95%、70%、5%的死亡[21]。尽管能够存活，完全敲除HTT会导致丘脑钙化以及小脑的铁代谢异常[22]。而选择性敲除神经元HTT可引起18% 的2月龄小鼠死亡，而4月龄小鼠能够正常存活[21]。因此不提倡过早在人体使用基因编辑技术，至少待机体发育成熟。而且基因编辑涉及的细胞种类、脑区仍有待进一步论证。
由于基因编辑目前并不可逆，wtHTT的功能尚未完全阐明，因此要求尽可能保留wtHTT的功能，这对等位基因特异性编辑提出更高的要求。CRISPR/Cas9基因编辑系统切割双链DNA的过程依赖PAM位点的存在。SNP的存在使得等位基因间存在不同的PAM位点，Shin 等[23]设计了成对gRNA，借助仅存在于突变基因上的SNP形成的PAM位点，在人源纤维母细胞实现中对HTT突变基因的精准删除。对于这类等位基因特异性策略的开发，依靠大量的HD患者遗传信息，且人种之间存在差异，然而目前缺乏关于我国突变HTT基因SNP的相关数据，这将制约了这一策略在国内人群的应用。
CRISPR/Cas9基因编辑技术的脱靶效应也备受学术界关注。研究发现在编辑系统导入后6 h内即完成对靶基因的编辑，此后Cas9蛋白以及gRNA的持续表达是导致脱靶效应的重要原因。因此，Merienne等[24]通过导入包含靶向HTT基因的gRNA(sgHTT)以及靶向Cas9基因的gRNA(sgCas9)的新型CRISPR/Cas9基因编辑系统，使该系统在切除HTT基因的同时，通过sgCas9将导入机体的Cas9基因切除，实现自我灭活。该技术在抑制mHTT表达的同时，能够大幅降低脱靶效应。此外，脱靶效应更低的Cas9蛋白以及防止双链DNA断裂的切口酶等相关研发工作也正在进行[25]。
一旦基因被成功编辑，疗效将持续维持，因此并不要求基因编辑相关外源基因的长期表达。利用脂质体等非病毒载体实现基因编辑是未来的发展方向。目前已能实现利用静脉注射的脂质体将外源mRNA导入猕猴神经元，指导合成功能蛋白[26]。未来进一步可实现在脂质体递送的相关mRNA指导下，目的细胞短期合成基因编辑所需元件。
2.1 前驱期与治疗时机的选择
HD的临床诊断主要依靠阳性家族史或基因诊断结果，以及典型的舞蹈样动作或锥体外系运动障碍。对于基因诊断阳性，而尚未出现运动症状的个体，称之为HD携带者或症状前HD患者。而对于出现运动症状，并在HD统一评定量表（unified Huntington’s disease rating scale,UHDRS）置信度评分4分或3分并伴有认知功能损害的患者，称之为症状期HD。并根据整体功能量表的评分，将症状期HD分为早期，中期及晚期。目前基因治疗临床试验主要招募早期HD患者，一方面考虑到这部分患者大脑病理改变较轻，临床获益的可能性较大，另外则是由于这部分患者生物标志物已有明显改变，可用于疗效评估。然而，作为一种功能获得型（gain of function）基因突变引起的遗传病，致病蛋白从出生即开始表达，主要影响着神经元的存活。至患者出现轻微症状时，已有相当数量的神经元丢失。因此，尽早治疗，延迟甚至防止发病，是最理想的治疗策略。然而，由于目前ASO基因治疗的费用高昂，高达100万欧元/年。在终身治疗难以实现的情况下，尽早预测或发现潜在发病患者，对于及时开展治疗具有重要意义。
目前提倡从症状前HD患者中再进一步细分出前驱期HD，即UHDRS量表置信度评分3分或2分并伴有轻微认知功能损害的患者[27]。前驱期患者的脑细胞已经出现受损的症像，但功能尚保持完好，属于可逆性损伤。这个时期治疗可以达到最佳的效价比，是HTT lowering治疗的理想人群。然而前驱期HD需要接受过相关训练的临床医生在详细的运动量表和认知功能评估后方可确诊，但是国内目前仅有小部分临床医师获得相关资质，而且繁复的评估与日常临床门诊工作实际不符，因此这部分患者在日常临床门诊中的诊断率偏低。随着基因治疗的普及，吸引更多的临床医生关注并参与到HD的治疗研究领域，以及开设专门的HD或遗传病门诊，可能能够推进前驱期HD的及时诊断。
2.2 治疗疗效的评估
基因治疗的目标主要是降低脑内mHTT的表达，延缓神经元死亡的进程，从而中止及逆转疾病进展。尽管临床症状是评估治疗效果的重要标准，但是具有滞后性，不能及时反映治疗效果。如何更加灵敏、精确、客观的评估HD治疗药物的疗效，对于临床试验以及未来临床决策都具有重要意义。
Ed Wild等人在2015年通过单分子计数技术(Single Molecule Counting)，成功在HD患者脑脊液中精确测量mHTT含量，并发现脑脊液mHTT含量与HD病程存在正相关关系。尽管目前尚不清楚脑脊液中mHTT来源，但是mHTT含量与神经丝轻链（neurofilament light chain，NfL）以及tau蛋白含量高度相关，提示其可能由神经元释放[28]。因此，在IONIS-HTTRx I期临床试验中，脑脊液mHTT含量首次被作为评价疗效的主要指标之一。
神经元损伤后，其细胞骨架成分--神经丝轻链将被释放至脑脊液进而入血。通过单分子蛋白阵列检测技术(SIngle MOlecular Array,SIMOA)，能够直接在血浆中测得NfL，从而能够实现无创评估神经元的损伤情况。Ed Wild等人发现脑脊液和血液中的NfL与HD的病情严重程度相关[29]。
在临床队列样本中，脑脊液mHTT、脑脊液和血浆NfL联合检测，是最早能够反应病情变化的生物标志物[30]。这些标志物的应用，为HD病人了解自身病情、药物开发疗效评估、临床决策提供重要依据。然而即使作为科研样本检测，该类指标在国内开展例数仍十分有限，未来这些指标用于临床常规评估仍有待进一步普及和推广。
随着对HTT基因和蛋白功能基础研究的不断深入，核酸药物研发以及各种基因工程技术取得了突飞猛进的发展，将会有更方便、更安全、更有效的治疗药物在临床试验中取得成功，走向临床。相信在不久的将来，除了优生优育、产前诊断外，临床神经科医生在对抗HD上，有更加强而有力的手段实现病情进展控制甚至根治。
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