AAV载体高剂量给药的安全性问题浅析

2020年美国基因与细胞治疗学会会议召开前一周，罕见病基因治疗领域发生了一场悲剧，5月6日，基因治疗公司Audentes(去年由Astellas制药公司收购)发布消息称X-连锁的肌管肌病(XLMTM)基因治疗（AT-132）临床试验（ASPIRO trial，NCT 03199469）中的一名儿童死于败血症，随后，在FDA的帮助下开始了调查，以确定这是否与大剂量腺相关病毒(AAV)治疗有关。不幸的是，近期(6月23日)，同一个临床试验队列中的又一个孩子在接受同样大剂量的AAV治疗后也死于败血症。此关键时刻，重要的是迅速而冷静地理清所发生的事情，并制定安全措施以防止再次发生此类悲剧。患者及其家属对治疗的信任是极重要的，没有他们的信任，基因治疗推进将举步维艰。

XLMTM是一种罕见的新生儿神经肌肉疾病。患者表现出严重的肌肉无力，这导致呼吸衰竭和喂养困难，通常只能生存到幼儿期。该疾病是由MTM1基因突变引起的，MTM 1基因编码肌微管蛋白（myotubularin），这是骨骼肌功能正常的必需蛋白，肌管蛋白在骨骼肌细胞的发育、维持和功能方面起着重要作用。

基因疗法AT-132以AAV8为载体将治疗基因运送到细胞内，AAV8是一种在基因治疗中非常常用的AAV血清型。ClinicalTrials.gov数据显示，在迄今进行的180个以AAV为载体的基因治疗试验中，有14个使用了AAV8(见表1)。重要的是，在迄今接受AAV8治疗的近250名患者中，没有发生任何其他严重的此类不良事件，表明了AAV8这种衣壳的高安全性。

表1

上述死亡的两位患者都在ASPIRO基因治疗临床试验的高剂量给药组。，每公斤体重给药3X10^14个载体基因组剂量(3X10^14vg/kg)。这是目前成人或儿童注射AAV的最高剂量之一(见表2)。此外，这两位患者年龄较小，都处于年龄下限的较高水平（低于5岁）。举个例子，假设这些患者4岁，那么他们很可能重13.5公斤，注射剂量超过4×10^15vg，这仅仅是对含有相应基因组的颗粒数的测量。AT-132基因疗法药物中空衣壳或不完整衣壳的数量未公开，其中的空衣壳或不完整衣壳将提高AAV8的给药剂量负担。业内目前没有通用的标准化方法来检测AAV载体的滴度，因此目前所有临床试验中AAV剂量应该被认为是近似的。

表2

AT-132基因治疗临床试验中高剂量给药组的三名男孩患者发展成严重的肝胆疾病；其中两名男孩死于细菌感染和败血症。虽然XLMTM是一种骨骼肌疾病，但其并发症往往包括许多其他器官系统，例如肝脏。据报道，死亡的两名男孩都患有某种形式的预先存在的肝胆疾病(其疾病细节未透露)。死亡事件可能与给药前患者存在的肝胆疾病相关，因为不管AAV最终的靶器官是什么，通过静脉给药的AAV都会经静脉传输到肝脏，因此，肝脏必定经过这些大剂量病毒的刺激，肯定会造成一定的肝脏毒性，如果肝脏事先已有损伤或功能障碍，那么其肝毒性会更甚。与此相关的是，在接受高剂量全身给药AAV的患者中发生了一些其他严重的不良事件（其严重程度不同）（见表3）。其副作用很大程度上是由于天然免疫反应(如炎症和补体激活)和特异性免疫反应所致。

表3

目前尚不清楚在AT-132基因治疗试验中的AAV8载体是如何制造出来的，使用了哪些纯化方法，以及在此剂量下改变是否可以提高安全性。也未报道这些患者之前存在的抗AAV8衣壳抗体的水平，因为其抗体水平与给药后副反应可能存在相关性。目前还没有标准化的检测方法来测量抗AAV衣壳的抗体水平，这对于该领域来说仍然是一个严峻的挑战。此外，还没有披露上述患者以前患有的肝胆疾病具体细节，但根据所列的试验排除标准（clinically significant underlying liver disease.）推测，上述患者的这种疾病可能并不严重。

上述高剂量AAV致死事件为我们敲响警钟，要进一步加强高剂量AAV基因治疗的安全性研究。在短期内，需要进行更多的临床前研究，以便更好地预测或了解更安全的给药剂量、毒性生物标志物，以及不完整衣壳水平、制造方法产生的杂质和不同纯化策略等参数对安全性影响。从长远来看，需要把注意力从“如何安全使用高剂量载体”转向“如何设计载体”，这样我们就不必使用高剂量载体，可以（或需要）在多个方面进行努力，包括：

（1）改造衣壳，使其能够更好地适应目标器官。

（2）改造启动子和组织/内环境调控元件。

（3）优化载体包装方法，同时能够满足生产需求，同时减少减少杂质。

（4）优化纯化方法，进一步减少杂质。

（5）提高对载体生产过程中AAV基础生物学的理解。

（6）更稳定的反向末端重复(ITR)基因组结构。

（7）避免免疫应答的新策略。

（8）优化给药方式或途径。

除了药物优化外，我们还必须考虑单单由体重来确定给药剂量是否合适。例如，两个体重相同的儿童，如果他们的疾病严重程度显著不同，是否应该给予相同的给药剂量？或者，经历过青春期的儿童与婴儿相比，目标器官的发育有差别，是否应该给予相同的给药剂量？或者患者的性别不同，是否应该给予相同的给药剂量？在许多人群中观察到AAV肝转导具有明显的性别二态性，男性表现出更高的肝转导。对于AAV转导的性别二态性问题，至少我们有一些研究数据可供参考。但对于不同发育状态和疾病严重程度的给药剂量问题，我们严重缺乏临床前的数据。

上述两个男孩的死亡事件对该领域的影响很大，作为科技人员和临床医生，有责任确保这种情况不会再次发生。希望能尽快公布更多的细节，以便使人们能够了解发生了什么，并设计出最佳的解决方案来推动这一领域的发展。

（微信公众号“基因治疗领域”近期将会在基因治疗的安全性方面做系列专题，敬请关注。）

参考资料：

1、https://www.joshuafrase.org/get-involved/recensus-study.php.

2、Search of: AAV | Interventional Studies – List Results – ClinicalTrials.gov. 

3、Search of: AAV8 | Interventional Studies – List Results – ClinicalTrials.gov. 

4、Mendell, J. R. et al. Single-Dose Gene-Replacement Therapy for Spinal Muscular Atrophy. New Engl. J. Med. 377, 1713–1722 (2017).

5、https://www.prnewswire.com/news-releases/audentes-announces-positive-interim-data-from-first-dose-cohort-of-aspiro-a-phase-12-clinical-trial-of-at132-in-patients-with-x-linked-myotubular-myopathy-300577455.html.

6、https://www.solidbio.com/about/media/news/letter-to-the-duchenne-community-about-the-status-of-the-ignite-dmd-clinical-trial.

7、https://www.fiercebiotech.com/biotech/solid-bio-sees-yet-another-clinical-hold-for-its-dmd-gene-therapy.

8、https://investors.pfizer.com/investor-news/press-release-details/2020/Pfizers-New-Phase-1b-Results-of-Gene-Therapy-in-Ambulatory-Boys-with-Duchenne-Muscular-Dystrophy-DMD-Support-Advancement-into-Pivotal-Phase-3-Study/default.aspx.

9、Wilson, J. M. & Flotte, T. R. Moving Forward After Two Deaths in a Gene Therapy Trial of Myotubular Myopathy. Human Gene Therapy (2020) doi:10.1089/hum.2020.182.

10、Flotte, T. R., Editor-in-Chief. Revisiting the ‘New’ Inflammatory Toxicities of Adeno-Associated Virus Vectors. Hum. Gene Ther. 31, 398–399 (2020).

Rumachik, N. G. et al. Methods Matter: Standard Production Platforms for 11、Recombinant AAV Produce Chemically and Functionally Distinct Vectors. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development vol. 18 98–118 (2020).

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13、https://www.genengnews.com.

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