阿斯利康团队重磅发现!LNP肝脏内源靶向依赖高密度脂蛋白HDL而非载脂蛋白ApoE
撰文:Vergil
编辑:RNAScript
已上市的多款COVID-19 mRNA疫苗强调了LNP作为mRNA递送载体的突出效用。虽然目前已经满足公众接种疫苗的迫切需要,但LNP配方和mRNA剂量上的设计仍采用一刀切的策略,无论年龄,性别和个人生理或病理多样性如何。已有多项研究证实这些个性化特征与LNP在不同个体内的递送转染效率息息相关。
目前针对LNP设计的工程化改进主要是以载体本身为中心,优化纳米颗粒的组分,尺寸或整体配方。然而,个体生理学和病理学是LNP设计的混杂因素,尚未有研究推导相关原理对LNP功能的具体影响。最近,围绕LNP在体内循环过程中形成的生物分子冠(Corona)已成为提高LNP效力的重要研究方向。给药后在LNP上形成的生物分子冠包含数百种生物分子(主要是蛋白质和脂质),为纳米颗粒构建了新的生物学特征。
生物分子冠组成差异巨大,受个体病理生理学、潜在疾病和联合用药的强烈影响,影响LNP药物的靶向、清除、分布和药物释放,例如肥胖个体中的纳米颗粒分布明显与健康个体不同。因此,在个体基础上破译生物分子冠组成将提供比标准化配方更有效的LNP设计,还需要对LNP周围的生物分子冠进行技术要求苛刻的多组学表型。
2023年7月6日,来自阿斯利康的研发团队在Nature Communications上发表了题为“Multiomics analysis of naturally efficacious lipid nanoparticle coronas reveals high-density lipoprotein is necessary for their function”的研究文章。本研究使用胖-瘦模型探索个体生理学对LNP生物分子冠形成的影响,以揭示导致LNP功效差异的生物分子成分。通过多组学分析蛋白质和脂质分子冠发现,肝细胞内源靶向的LNP可能依赖的是高密度脂蛋白(HDL)而非载脂蛋白(ApoE)。
不同胖瘦个体中LNP效力
和生物分子冠组成研究
个体生理条件对LNP效力的影响
研究人员使用从不同胖瘦的Zucker大鼠中提取的血浆细胞培养物(肥胖血浆Obese Plasma,OP;瘦血浆Lean Plasma,LP)在体外比较了eGFP mRNA表达(图1a)。肥胖的Zucker大鼠血浆显示出自发性高脂蛋白血症和较低水平的肝低密度脂蛋白受体(LDLr),导致血浆中极低密度脂蛋白(VLDL)和HDL的数量较高。肥胖个体中肥胖生物标志物显着升高:胆固醇、甘油三酯、天然磷脂和ApoE。
影像学数据分析表明,冠的形成和不同组分对于LNP介导的摄取和mRNA表达是必不可少的。在一定条件下,肥胖血浆OP可以提高LNP的疗效。在没有血浆的肝细胞系中,所有mRNA剂量组LNP细胞摄取量最小,eGFP表达可忽略不计。而在1%不同血浆中给药时可观察到明显的差异,肥胖血浆OP可提高5至10倍LNP效力(图2b,c)。 在较低的LNP剂量下,瘦血浆LP和肥胖血浆OP对LNP效力的影响对比并不明显。同时,表达差异在肾成纤维细胞中也不如在肝细胞中明显。
该模型还显示,较高的ApoE含量在评估的剂量范围内没有显着增加受体肝细胞中的eGFP表达水平。相比之下,1%的OP补充剂导致最高的eGFP表达,表明除ApoE外有其他生物分子机制上调了蛋白质表达(图2e)。基于此,研究人员假设导致转染差异的生物分子冠存在可检测的不同。
图1. 在瘦弱和肥胖条件下评估LNP效力的实验设计和表征。
生物分子冠分离表征方法
研究人员因此开发了一项名为“fit-for-purpose affinity-based magnetic isolation workflow(基于亲和力的磁隔离工作流)”的分离程序,使用小型化、高通量的96孔板分离LNP与生物分子形成的内源性纳米冠结构(LNPcor),包含三个基本步骤:LNPcor捕获、洗涤和洗脱(图2a)。LNPcor复合物在瘦和肥胖血浆样品中具有相似的回收曲线。低温透射电子显微镜(Cryo-EM)下观察到,在LP中形成的LNPcor主要表现为电子致密球体,而OP LNPcor却具有多层结构。
图2. 96孔板磁隔离分离方法
个体生理条件对LNP生物分子冠组成的影响
研究人员接下来专注于表征单个瘦和肥胖血浆中形成的LNPcor,并使用定量蛋白质组学评估单个冠状体组成,揭示瘦和肥胖LNPcor之间的差异。整体而言,肥胖血浆衍生的生物分子冠所含的蛋白质是瘦血浆的1.8倍(图3a),生物分子冠载脂蛋白的平均相对蛋白质丰度(RPA)从76.04%增加到94.40%(图3b)。
一般来说,LNP蛋白冠不是简单地模仿血浆蛋白组成,这意味着LNP选择性结合形成冠的蛋白质。尽管LNP暴露于肥胖血浆后eGFP表达有所改善,但与来自瘦血浆的样品相比,所有肥胖血浆来源的冠状结构中的ApoE丰度均有一定程度的降低(图1b)。
图3. 瘦/肥胖血浆衍生LNPcor的蛋白质组学分析
脂质通常也与载脂蛋白结合,形成脂蛋白颗粒,可能时LNPcor富含载脂蛋白的原因。因此,研究人员检测了LNPcor中的脂质含量,结果显示肥胖血浆衍生冠中的脂质含量明显升高。此外,除鞘磷脂SM以外的所有检查的脂质含量(磷脂酰胆碱PC、溶血磷脂酰胆碱LPC、磷脂酰乙醇胺PE)均普遍更高。
图4. 蛋白冠的脂质组学谱
结合对LNPcor的蛋白质组学、脂质组学分析可以发现,不同个体生理条件确实会对LNP生物分子冠的组成含量造成影响,并会进一步影响LNP的效力。
识别调节LNP功效的生物分子冠成分
研究团队开发了一项验证计算模型,利用正交偏最小二乘分析(OPLS)来揭示不同血浆衍生的单个生物分子冠与eGFP表达之间的潜在多变量相关性。如图5a所示,生物分子冠组分含量(蛋白质和脂质含量)为X变量,定量成像得到的eGFP表达(AUC/10h)为Y 变量。
图5. OPLS相关模型
HDL而不是ApoE驱动肝脏LNP mRNA递送
虽然ApoE通常被认为与LNP肝递送功效高度相关,但与瘦血浆来源冠相比,肥胖血浆衍生冠中ApoE的含量略有下降。回看前期研究发现,当LNP结合肥胖血浆形成ApoE含量较少的冠时,荧光成像反而显示更多的细胞eGFP mRNA表达。这些情况表明,单个蛋白冠的ApoE含量和eGFP表达之间仅存在中等相关性,相比之下,个体蛋白冠ApoM水平与细胞eGFP表达之间的相关性更为紧密。
虽然并非所有LNP冠的蛋白质成分都能改善LNP功能,但与LNP相关的大多数脂质确实与增强的LNP性能相关。一般来说,富含脂质的冠更有利于LNP介导的mRNA递送。然而,脂质的正交性高于大多数蛋白质(正交性>0.1或<-0.1),这表明形成冠的蛋白质更适用于解释瘦和肥胖情况下LNP功能之间的差异。
根据图5b,c数据表明,HDL颗粒是生物分子冠成分中最可能影响LNP效力的来源。因此,研究人员接下来将Huh7肝细胞与1%瘦血浆一起暴露于纯化的HDL,VLDL和CM中,以确定这些成分如何影响细胞mRNA表达。
研究发现,与其他脂蛋白不同,只有用HDL增强的冠状物才能增强细胞对LNP摄取的反应。即使在最低的加标浓度下,单独HDL也可以增强细胞对LNP的反应。然而,在较高的HDL浓度下,观察到eGFP mRNA表达下降。相比之下,在任何浓度下添加VLDL和CM都不会影响LNP性能(图5d)。当HDL、VLDL和CM以相等的浓度加标时,LNP性能增强与单独使用HDL没有区别。相反,在较高的加标剂量下,组合所有脂蛋白颗粒在一定程度上减轻了使用较高剂量的HDL时观察到的eGFP表达减少。
在较低的LNP剂量下,最大mRNA表达发生在较低的HDL浓度下,而高LNP剂量导致较高的mRNA表达,但需要更多的HDL才能达到最大水平(图5e)。有较高HDL水平的肥胖血浆明显抑制了细胞对具有预先形成的富含HDL冠状物的LNP摄取。该结果表明,蛋白冠高密度脂蛋白和LNP在药物递送方面存在明显恒定的最佳比率。在高HDL剂量下细胞eGFP表达的下降可能是由于冠成分与血浆中未结合的对应物与细胞表面受体之间的竞争加剧。
值得注意的是,HDL和VLDL都可以为LNPcor贡献ApoE。虽然VLDL确实与LNP相互作用并有助于电晕形成,但并没有改善LNP功能。
HDL如何影响LNP的摄取
为了进一步了解蛋白冠组成如何影响纳米颗粒的摄取,LDLr和广泛认可的HDL受体,清道夫受体B1(SRB1),分别或同时用siRNA沉默。使用蛋白质印迹法验证Huh1肝细胞对LDLr和SRB7的表达。 在LNP给药之前,用敲低特定受体表达的siRNA处理细胞48小时,然后在上述相同条件下给药LNP。
在没有HDL的情况下,与对照siRNA处理的细胞相比,抑制LDLr显著降低了LNP摄取,而抑制SRB1却不影响摄取。相反,当LPDS添加HDL增强时,沉默两个受体(单独或组合)会降低LNP摄取。这证实了LDLr介导LNP的一般摄取,而SRB1能够通过HDL增强的蛋白冠特异性促进LNP的肝细胞内化(图6c)。
为了验证相关发现,研究者探究了当循环中血浆成分(包括HDL)达到生理水平时,用HDL补充LNP是否可以改善其在体内的性能。通过尾静脉向瘦Zucker大鼠注射含有eGFP mRNA的MC3 LNP。LNP注射前在1%LPDS中与额外的HDL预孵育4小时以形成含有HDL的蛋白冠(HDL组),或仅与1%LPDS(非HDL组)一起孵育。
LNPs给药6 h后处死大鼠,用ELISA法测定eGFP在肝、脾和肾中的表达,表明具有HDL增强蛋白冠的LNPs在肝脏中表达较多,在其他器官中表达较少(图6d)。
此外,与非高密度脂蛋白组相比,在4小时内,用HDL补充LNP导致肝脏蛋白质产量增加6倍。在没有HDL预孵育的情况下,LNP也被其他器官更多地吸收,这表明减少HDL结合的工程化颗粒可能是促进肝外递送的有效策略。
这些结果表明,血浆中适当的HDL水平可以改善具有不同成分蛋白冠的LNP功能。
图6. HDL可作为有效的LNP调节剂
小结
本项研究表明,直接研究蛋白冠成分比血浆生物标志物更能预测LNP的功效。研究发现了HDL与LNPcor,游离HDL、以及HDL介导的细胞摄取能力之间的关系:在较高的血浆浓度下,游离HDL具有拮抗作用,而较低的血浆浓度导致游离HDL水平降低,颗粒摄取增加,从而改善mRNA表达。
在最低的瘦血浆浓度下,没有足够的HDL可以形成LNPcor,特别是在使用高剂量LNP时,降低了LNP的性能。然而,在肥胖大鼠血浆中HDL的数量更高,因此即使在低肥胖血浆浓度下LNPs仍然起作用,并且在这些条件下,来自未结合的HDL竞争也减少。用HDL增强LNP蛋白冠可以打破有利于LNP的平衡,并允许它们与内源性HDL颗粒竞争体内细胞受体(如SRB1),增加细胞摄取。
综上所述,这些结果首次表明LNP设计可以通过影响纳米颗粒与HDL的相互作用来调节LNP效力和靶向性。
大多数早期研究将LNP递送,特别是肝脏递送,认可为ApoE介导的机制。但出于分析技术的原因,对ApoE的来源知之甚少。不同的ApoE脂质结合状态以及与游离ApoE的竞争可能会模糊与蛋白冠ApoE诱导的摄取的相关性。我们发现,不仅蛋白冠的ApoE含量不是模拟LNP效力的最佳指标,而且当考虑整个蛋白冠的组成时,它往往与实际效力呈负相关。
ApoE对大多数LNP的功能很重要,但ApoE分子的来源也很重要。目前的研究表明,在含有ApoE的脂蛋白中,只有HDL调节LNP mRNA表达功效,即使其他脂蛋白颗粒可以为LNPcor贡献ApoE。目前还不完全清楚HDL颗粒究竟如何增强LNP功能,但这可能相当复杂,阐明该机制将是未来工作的重点。
HDL组分在LNP蛋白冠中的独特增强作用也意味着在蛋白冠组成方面,脂蛋白ApoM和/或ApoAII可以更好地预测LNP效力。这自然也带来了联合药物治疗如何影响纳米药物的治疗效果的问题。虽然常用的降胆固醇药物如他汀类药物对高密度脂蛋白有中等刺激作用,但贝特类(Fibrate)和处方程度的烟酸(也可以在日常饮食中获得)可以有效提高高密度脂蛋白水平,对LNP的使用剂量和具体功能产生影响。
虽然设计LNP以促进特定的蛋白冠成分是一项重大的工程挑战(图7),但这些成分相互作用的复杂性为提高安全性,降低成本,靶向组织以及针对特定的生物学和病理生物学环境调整治疗颗粒创造了更多机会。
图7. 蛋白冠筛查和多组学分析揭示LNP与蛋白冠成分含量间的关系。
参考资料
Liu K, Nilsson R, Lázaro-Ibáñez E, Duàn H, Miliotis T, Strimfors M, Lerche M, Salgado Ribeiro AR, Ulander J, Lindén D, Salvati A, Sabirsh A. Multiomics analysis of naturally efficacious lipid nanoparticle coronas reveals high-density lipoprotein is necessary for their function. Nat Commun. 2023 Jul 6;14(1):4007. doi: 10.1038/s41467-023-39768-9.
E.N.D
往期文章推荐:
华毅乐健商业化生产基地正式投入使用,国内领先的AAV病毒类产品商业化生产基地
饶毅创建的华毅乐健再迎重要里程碑 |血友病AAV基因疗法完成注册临床I期首例受试者入组
一文读懂体外基因疗法中最常用载体----慢病毒载体现状与进展
支持资金最高达1亿元,北京昌平出实招重点支持CGT、新一代抗体、AI新药研发、人体组织再生、类脑智能等医药健康产业发展
对恒河猴开展的临床前研究表明,单次注射CRISPR-Cas9基因疗法能清除艾滋病病毒
我国未来生物医药产业值得关注的十大领域,基因编辑、细胞治疗、新型药物递送技术上榜
国内AAV基因疗法步入爆发前夕,25款IND获批,3款进入III期临床
新药pre-IND + IND+ NDA及国内药品注册沟通交流制度介绍与思考
发改委等多部门发文明确支持民企在人工智能、细胞和基因医疗等六大领域科技攻关